基于UHPLC-Q-TOF/MS的地榆化学成分分析及大鼠体内代谢研究

裴玉琼,徐坠成,王艳天,顾欣,盛先杰,徐艺,缪志伟

(1.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;2.南京中医药大学附属医院,江苏 南京 210029;3.南京中医药大学附属张家港医院,江苏 张家港 215600)

地榆SanguisorbaofficinalisL.为蔷薇科植物的干燥根,具有凉血止血,解毒敛疮等功效[1]。地榆及其复方制剂应用广泛,临床多于治疗便血、痔血、血痢、烧伤、烫伤和慢性肠道感染[2-4]。地榆化学成分丰富,主要含酚类、黄酮类、三萜类等化合物[5-6]。地榆中的地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ等具有较好的抗炎和抗癌作用,而鞣花酸、没食子酸、儿茶素及其衍生物等可用于抗感染、抑菌、抗氧化、抗皱、抗过敏和神经保护等[7-9]。

全面阐释中药活性成分在体内的代谢情况对中药药效物质基础研究极为重要[10]。超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF/MS)技术是目前对样品进行快速定性和半定量分析的常用方法之一,具有高灵敏度、高分离能力和高效率的显著优势。中药药源性成分繁多,在生物样品中含量较低,加之内源性物质和基质带来的干扰,给生物样本里中药成分的分析带来困难。因此,应用先进的液质联用技术,排除干扰后还可以捕捉到众多低含量组分的二级质谱信息,从而鉴定到更多的代谢产物,对代谢途径的正确推测也提供了帮助[11]。

目前文献中仅见地榆水提物在化学成分群中的研究[5],缺少地榆，尤其是鞣质类成分在体内代谢过程的研究。因此,本研究拟对地榆水提物体内代谢产物进行全面分析,以期为进一步解析地榆体内代谢过程,阐明其药效物质基础提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

Triple TOF 5600TM质谱仪(美国AB SCIEX公司);Prominence LC-20A超快速高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司);Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司);Speed Vac离心浓缩仪(美国Thermo Scientific公司);电热恒温鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)。

1.2 药材与试剂

对照品没食子酸(批号:18032703),地榆皂苷Ⅰ(批号:18030201),地榆皂苷Ⅱ(批号:RFS-D0231),儿茶素(批号:154-23-4),山柰酚(批号:520-18-3)购自成都瑞芬思生物科技有限公司。对照品鞣花酸(批号:E102710)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。对照品尿石素A(批号:APN698)购自上海毕得医药科技股份有限公司。对照品尿石素B(批号:B28N9D76184)购自上海源叶生物科技有限公司。对照品槲皮素(批号:10081-9905)购自中国药品生物制品检定所。所有对照品纯度均≥98%。地榆药材(批号:18101501)购自汕头市粤东药业有限公司。甲醇、乙腈(色谱纯,德国Merk公司),甲酸(色谱纯,阿拉丁试剂有限公司),水(色谱纯,美国Millipore公司)。

1.3 动物

SD大鼠,雄性,SPF级,体质量180～220 g,购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场,许可证号:SYXK(苏)2018-0049,动物合格证编号:201931580。饲养于SPF环境,自由饮水、进食,室内温度(22±2)℃,湿度(50±5)%,12 h/12 h昼夜循环。本实验符合《江苏省实验动物管理条例》中实验动物伦理道德的相关规定,动物实验伦理审查表号:AEWC-20201201。

2 方法

2.1 地榆水提物和对照品溶液的制备

取地榆药材100 g,水煎煮2次,每次1 h,第1次10倍体积水,第2次8倍体积水。合并煎液过滤,滤液70 ℃减压浓缩至生药量为1 g·mL-1。取200 μL加入800 μL超纯水混匀,涡旋3 min,通过固相萃取(SPE)小柱(美国Waters公司)进行分离纯化,将滤液收集挥干后,加入200 μL甲醇,涡旋3 min,4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min,取上清为地榆水提物供试液。

分别精密称取没食子酸、地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ、鞣花酸、尿石素A、尿石素B、儿茶素、山柰酚和槲皮素对照品适量,以甲醇溶液配制成质量浓度都为200.0 ng·mL-1的对照品混合溶液。

2.2 动物给药与样品采集

将12只SD大鼠饲养于代谢笼中,分为空白组与给药组,每组6只。实验前禁食12 h,期间自由饮水,为了寻找更多的代谢产物,按照人剂量的2倍[1],给药组灌胃地榆水提物3 g·kg-1(生药量);空白组灌胃等量的生理盐水。于给药后0、0.5、1、2、4、6、8、12 h眼眶取血于肝素钠处理的EP管中,4 000 r·min-1离心10 min,取上清,即得血浆样品。将大鼠置于代谢笼中，收集24 h尿液和粪便。以上样品均于-20 ℃保存备用。

2.3 生物样品前处理

血浆样本供试液制备:将不同时间点血浆等体积混合均匀后,取600 μL混合后的血浆加入2.4 mL超纯水稀释,通过C18SPE小柱(美国Waters公司)进行分离、富集,将滤液收集挥干,加入200 μL甲醇,涡旋3 min,4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min,取上清液为血浆样本供试液。

尿液样本供试液制备:取1.5 mL尿液加入1.5 mL超纯水,涡旋3 min,通过C18SPE小柱(美国Waters公司)进行分离纯化,将滤液收集挥干,加入200 μL甲醇,涡旋3 min,4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min,取上清液为尿液样本供试液。

粪便样本供试液制备:粪便于40 ℃下恒温干燥后称取0.3 g,加入3 mL乙腈-甲醇-水(体积比5∶3∶2),超声30 min,4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min,取上清液挥干,加入3 mL超纯水复溶,涡旋3 min,通过C18SPE小柱(美国Waters公司)进行分离纯化,将滤液收集挥干,加入200 μL甲醇,涡旋3 min,4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min,取上清液为粪便样本供试液。

2.4 色谱条件

色谱柱:Thermo AcclaimTMRSLC 120 C18柱(3.0 mm×100 mm,2.2 μm),柱温:40 ℃,流动相A:0.1%甲酸水,流动相B:乙腈。流速:0.4 mL·min-1,进样量:3 μL。梯度洗脱程序:0～3 min,10%B;3～18 min,10%～90%B;18～25 min,90%B;25～28 min,90%～10%B;28～30 min,10%B。

2.5 质谱条件

采用正、负离子检测模式,扫描范围为m/z50～1 500,电喷雾离子源(ESI),离子源温度(TEM):550 ℃;气帘气(CUR):40 psi(1 psi=6.89 kPa);雾化器(GS1):55 psi;辅助加热器(GS2):55 psi;离子源喷雾电压(IS):5 500 V/-5 500 V;碰撞电压(CE):40 V/-40 V;去簇电压(DP):100 V/-100 V。

2.6 数据处理

通过文献建立地榆化学成分数据库,使用MetabiolitePilotTM和Peakview 1.2进行数据处理。

3 结果

3.1 地榆水提物化学成分及其质谱裂解规律解析

通过查阅国内外文献[3,12-13],鉴定了地榆中45个化学成分,包括33个酚类成分、8个三萜类成分及3个黄酮类成分和1个单萜烯醇苷,其中7个化合物通过与对照品的保留时间及其裂解碎片比较得到进一步确认，详见图1和表1。

注:*表示化合物与对照品确认。图1 地榆水提物和对照品在正、负离子模式下的基峰离子色谱

表1 地榆水提物化学成分鉴定

(续表)

注:*表示化合物与对照品确认。

地榆水提物在正、负离子模式下进行UHPLC-Q-TOF/MS分析,发现地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ和地榆皂苷Ⅲ只在负离子模式下能被检测到碎片离子,MS/MS谱图和碎片路径如图2所示[4，8]。与对照品相比，地榆皂苷Ⅰ的母离子为m/z765.444 5[M-H]-(C41H66O13)和m/z811.449 9[M+HCOO]-(C41H66O13)。[M-H]-很容易消除1个葡萄糖(Glu)产生碎片离子m/z603.389 0[M-H-C6H10O5]-(C35H56O8)，它可以通过H2O的中性丢失进一步在m/z585.380 2[M-H-C6H10O5-H2O]-(C35H54O7)处生成碎片离子。对于地榆皂苷Ⅱ，母离子为m/z603.390 8[M-H]-(C35H56O8)，碎片离子m/z585.379 8[M-H-H2O]-(C35H54O7)是由母离子H2O中性丢失产生的。此外，还可以清楚地观察到地榆皂苷Ⅲ的母离子为m/z633.399 2[M-H]-(C36H58O9)和m/z679.404 6[M+HCOO]-(C36H58O9)，丢失1个Glu后产生碎片离子m/z471.355 1[M-H-C6H10O5]-(C30H47O4)，而碎片离子m/z453.335 0[M-H-C6H10O5-H2O]-(C30H45O3)是进一步H2O中性丢失产生的。三萜类化合物极易发生中性小分子碎片(H2O)丢失。

图2 地榆皂苷Ⅰ(A)、地榆皂苷Ⅱ(B)和地榆皂苷Ⅲ(C)的MS/MS

3.2 血浆、尿液及粪便的代谢产物分析

运用MetabiolitePilotTM2.0软件导入原型成分结构,并将空白组和给药组样本进行代谢产物鉴定筛选。通过对比空白组和给药组样品色谱峰的保留时间及质谱数据,运用Peakview 1.2软件结合对照品、参考文献及地榆化学成分的质谱裂解规律,对地榆体内代谢产物进行了鉴定。原型成分及代谢产物具体信息见表2。从大鼠血清、尿液及粪便中共检测出69个外源性成分，包括24个原型成分和45个代谢产物。其中24个原型成分包括16个酚类成分、7个三萜类成分及1个单萜烯醇苷。地榆在大鼠体内的代谢途径主要包括还原、甲基化、脱水、氧化、硫酸化及葡萄糖醛酸结合等。

3.2.1 酚类及其代谢产物的鉴定 从正、负总离子流图的化合物分析可知,地榆水提物的主要成分为酚类化合物。在给药组生物样品中检测到没食子酸、没食子儿茶素、表儿茶素、儿茶素等16种酚酸类原型成分。原型成分中未检测到鞣花酸，可能是因为其本身为多酚类化合物,而多酚类化合物较难吸收入体内，容易在胃肠道被内源性物质代谢为尿石素A、尿石素C、尿石素D等,其代谢产物主要发生甲基化和葡萄糖醛酸化等反应。

以鞣花酸代谢途径为例,详见图3。代谢产物C2的母离子为m/z169.015 0[M-H]-(C7H6O5),碎片离子m/z125.025 1是由其脱去1分子羧基得到的,与对照品匹配误差较小,故推测代谢产物C2为没食子酸。代谢产物C25-10的母离子m/z315.014 5[M-H]-(C15H8O8)与鞣花酸母离子m/z300.998 7[M-H]-(C14H6O8)相差14,故推测C25-10有可能为鞣花酸甲基化得到的产物。代谢产物C25-9的母离子m/z275.020 1[M-H]-(C13H8O7),通过文献对比[14]和碎片离子信息匹配,证实其为尿石素M5。代谢产物C25-7m/z259.025 6[M-H]-(C13H8O6)与尿石素M5母离子275.020 1[M-H]-(C13H8O7)相差16,推测代谢产物C25-7可能是尿石素M5在C环上损失1分子羟基得到的,其碎片离子信息与文献对比[14]一致,鉴定其为尿石素D。代谢产物C25-8m/z261.040 7[M-H]-(C13H10O6)与尿石素D母离子相差2,鉴定其可能为尿石素D还原反应的代谢产物。代谢产物C25-5m/z243.030 4[M-H]-(C13H8O5)与尿石素D母离子相差16,推测代谢产物C25-5可能是尿石素D在A环上损失1分子羟基得到的,其碎片离子信息与文献[14]对比一致,鉴定其为尿石素C。代谢产物C25-6m/z241.014 6[M-H]-(C13H10O6)与尿石素C相差2,推测C25-6可能为尿石素C氧化反应的代谢产物。代谢产物C25-1m/z227.035 5[M-H]-(C13H8O4)与尿石素C母离子m/z243.030 4[M-H]-(C13H8O5)相差16,推测代谢产物C25-1可能是尿石素C损失1分子羟基得到的,通过与文献[14]中碎片离子信息比对,鉴定其为尿石素A。而代谢产物C25-2m/z306.991 7[M-H]-(C13H8O7S)、C25-3m/z241.052 0[M-H]-(C14H10O4)和C25-4m/z403.067 0[M-H]-(C19H16O10)结合已知文献报道[14]的代谢产物结构分析,最终被推测为甲基化硫酸化尿石素A、甲基化尿石素A和葡萄糖醛酸化尿石素A。

表2 血浆、尿液和粪便中原型成分和代谢产物的鉴定

(续表一)

(续表二)

3.2.2 三萜皂苷类及其代谢产物鉴定 皂苷原型成分口服给药后往往吸收较差，其体内代谢通常经由胃肠道的水解和吸收入血后肝脏的代谢两步完成[15]。本实验以地榆皂苷Ⅰ代谢途径为例,详见图4。地榆皂苷Ⅰ的母离子m/z765.444 2[M-H]-(C41H66O13)，碎片离子m/z603.389 2[M-H-C6H10O5]-(C35H56O8)为母离子消除1个Glu所产生。代谢产物C39-1m/z603.388 2[M-H]-(C35H56O8)与地榆皂苷Ⅰ的母离子相差162,且存在碎片离子m/z585.380 7[M-H-H2O]-,误差较小,故推测代谢产物C39-1为地榆皂苷Ⅰ丢失1分子Glu的代谢产物。代谢产物C39-2m/z471.346 3[M-H]-(C30H48O4)与地榆皂苷Ⅰ的母离子相差294,推测其为脱去1分子Glu和1分子阿拉伯糖(Ara)的代谢产物,碎片离子m/z453.335 6[M-H-H2O]-为H2O中性丢失产生。代谢产物C39-3m/z669.375 8[M+Cl]-(C36H58O9)与地榆皂苷Ⅰ的母离子相差132,推测其为脱去1分子Ara所得，该代谢物的主要2个碎片离子m/z471.347 7[M+Cl-C6H10O5-2H2O]-、m/z453.339 1[M+Cl-C6H10O5-3H2O]-推测是分别通过丢失1分子Glu和进而丢失H2O产生的。代谢产物C39-4m/z469.330 2[M-H]-(C30H46O4)与地榆皂苷Ⅰ的母离子相差296,推测丢失1分子Glu、1分子Ara和2个氢离子,碎片离子m/z451.320 8[M-H-H2O]-,m/z407.330 7[M-H-H2O-CO2]-分别为H2O中性丢失和继而丢失1分子CO2所致。代谢产物C39-5m/z455.348 9[M-H]-(C30H48O3)与地榆皂苷Ⅰ的母离子相差310,推测为丢失1分子Glu、1分子Ara和水合脱氧产物,碎片离子m/z437.336 0[M-H-H2O]-为H2O中性丢失产生。地榆皂苷Ⅰ的代谢产物都会发生中性小分子碎片(H2O)丢失,这可能是因为三萜类化合物的母核在体内被氧化时,在碎裂过程中会出现额外的脱水现象,脱水部位形成双键,从而改变了原型中的特征离子[16]。去阿拉伯糖基化和去葡萄糖基化是地榆皂苷Ⅰ的主要代谢途径。

图3 鞣花酸化合物的代谢途径

图4 地榆皂苷Ⅰ的代谢途径

4 讨论

本研究采用UHPLC-Q-TOF/MS技术,在灌胃给予地榆水提物后,从大鼠血清、尿液及粪便中共鉴定出69个外源性成分,包括24个原型成分和45个代谢产物。其中24个原型成分包括16个酚类成分、7个三萜类成分及1个单萜烯醇苷,分别为没食子酸、没食子儿茶素、原花青素B3、儿茶素、表儿茶素、短叶苏木酚酸、地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ、地榆皂苷Ⅲ、坡模醇酸等。在45个代谢产物中,有33个来源于酚类成分,6个来源于三萜类成分和6个来源于黄酮类成分。由此可初步判断,地榆水提物发挥药效成分的物质基础主要来源于酚类成分。有研究表明[17],鞣花酸及其代谢产物尿石素可有效改善肠道微生物菌群，预防或抑制肠道疾病的发生发展。鞣花酸及尿石素的作用主要包括抗氧化、抗炎及微生物菌群调控等[18]。我们在皂苷类及其代谢产物鉴定中,发现地榆皂苷Ⅰ的代谢产物都会发生中性小分子碎片(如H2O)丢失,其主要代谢途径为去阿拉伯糖基化和去葡萄糖基化。

在这69个外源性成分中,有22个可在血浆中被检测到,12个可在尿液中被检测到,62个可在粪便中被检测到。其中,在血浆中能够被测到的主要为没食子酸鞣质类成分及其代谢产物,而三萜类成分因吸收较差而较少有血浆暴露。结果表明,粪便排泄是地榆水提物主要的排泄途径,部分原型成分和代谢产物尚未进入血液循环就通过粪便被排出体外。例如,在地榆水提物中可以检测到鞣花酸的存在,但是在大鼠血清、尿液及粪便中均未检测到鞣花酸,可能是因为其本身为多酚类化合物,而多酚类化合物较难吸收入体内,容易被内源性物质代谢为尿石素类化合物。也可能是因为鞣花酸浓度太低,低于检测限。

结果表明,地榆水提物在大鼠体内的代谢途径主要包括还原、甲基化、脱水、氧化、硫酸化及葡萄糖醛酸结合等反应。本研究首次利用UHPLC-Q-TOF/MS技术对地榆水提物化学成分及其代谢产物进行系统性研究,为阐明其药效物质基础提供实验依据。