增强型基质去除净化-UPLC-Q-TOF/MS法快速测定奶粉中的香兰素类化合物

马启明，梁小敏，曾广丰

（1.广州检验检测认证集团有限公司，国家加工食品质量检验中心（广东），广州 511447；2.广州海关技术中心，广州 510623）

0 引言

香兰素（Vanillin）及其同系物是一类重要的食品添加剂，具体奶香的气味。因为具有强烈的奶香味，可增加食欲[1]。有研究指出，香兰素对奶牛的生产性能及血清生化指标无显著影响[2]，但大量的摄入香兰素对肝脏和肾脏的功能造成损害[3]。《GB 2760-2014食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中也规定较大婴儿和幼儿配方食品中香兰素和乙基香兰素的最大使用量为5 mg/100 mL[4]，0～6 个月的婴幼儿食品更是不得添加。但为了令产品更加吸引婴儿或其他消费者，质量安全问题存在着较大的隐患。

目前，香兰素的检测方法主要集中在气相色谱法[5]、气相色谱-质谱法[6-9]、液相色谱法[10-11]和液相色谱-串联质谱法[12-14]，本文建立的超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱法（Ultra performance liquid chro⁃matography-quadrupole time of flight mass spectrome⁃ter，UPLC-Q-TOF/MS），对目标物的分子量进行精确测定，相对于串联质谱法有更强的定性能力。方法的回收率，精密度和检出限都能达到日常分析测定的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

奶粉，广州市售；无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸氢二钠和柠檬酸钠（分析纯），广州试剂厂；乙腈（色谱纯），美国Fisher 公司；甲酸（色谱纯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；石墨化炭黑（GCB）、十八烷基键合硅胶（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）、增强型基质去除固相吸附剂（EMR），美国安捷伦公司；香兰素、香豆素、甲基香兰素、乙基香兰素标准品（纯度≥99.8%），德国Dr.EhrenstorferGmbH 公司。

1.2 仪器与设备

Triple TOF®5600+高分辨质谱仪，美国ABsciex公司；UPLC 20AD 高效液相色谱仪，日本岛津公司；电子天平；4k-15 离心机，北京卓明贸易有限公司；IKA Vortex4 涡旋混匀器，广州仪科实验室技术有限公司；Milli-Q 去离子水发生器，美国Millipore公司。

1.3 实验条件

1.3.1 标准溶液的配制

储备液：分别准确称取适量香兰素、香豆素、甲基香兰素、乙基香兰素的标准品于10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成质量浓度为500 mg/L 的标准储备液，于-4 ℃冰箱储存备用。

中间液：用乙腈将储备液稀释至20 mg/L，得到标准中间液，，于-4 ℃冰箱储存备用。

工作曲线（基质曲线使用空白基质液配制）：吸取上述中间液用乙腈稀释成工作曲线，各单点质量浓度分别为2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100，200 mg/L。

1.3.2 样品前处理方法

准确称取奶粉样品2 g 于50 mL 离心管中，加入15 mL 水，充分溶解以后加入10 mL 乙腈。充分混匀后加入4 g 无水硫酸镁、1 g 氯化钠、0.5 g 柠檬酸氢二钠和1 g 柠檬酸钠，摇床提取20 min，10 000 r/min 离心5 min。称EMR 净化剂1 g 于15 mL 离心管中，先用2 mL 水活化5 min，然后转移上清液到此离心管中，涡旋混合10 min，4 000 r/min 离心5 min。取3 mL上清液用1 g 无水硫酸镁吸水后，过0.22 μm 有机膜待上机测定。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Atlantis T3 C18（150 mm× 2.1 mm，3.0 μm）；柱温为40 ℃；样品室温度20 ℃；进样量为5 μL；流动相A 为乙腈，B 为体积分数0.1%的甲酸水溶液，采用梯度洗脱方式洗脱分离：0～10 min 5%～50% A，10～12 min 50%～80% A，12～13 min 80%～5% A，13～15 min 5% A；流速为0.35 mL/min。

1.3.4 质谱条件

离子源：ESI 和APCI 复合源；扫描方式：正离子扫描；APCI 源连接ABsciex 公司自动校正系统（CDS），每5 个样品进行1 次自动校正，正离子模式校正液流速为0.5 mL/min，气帘气：276 kPa，离子源雾化气：345 kPa，离子源加热辅助气：345 kPa，离子源温度：500 ℃，离子源电压5 500V。一级（TOF）扫描质量范围（m/z）：50～1 000 u；二级IDA-MS 扫描准确质量范围：50～1 000 u，DP：60V，CE：（25±10）V；高灵敏模式，数据采集时间50 ms，信号阈值100（每秒采集的电子数）。

2 结果与分析

2.1 待测化合物的质谱分析依据

根据TOF-MS 和IDA-MS 高分辨质谱获得化合物的数据，定性定量分析奶粉中的香豆素和3 种香兰素。采用LC-Q-TOF-MS液相色谱高分辨质谱方法检测分析奶粉中的香豆素和3 种香兰素，根据所采集的化合物保留时间、一级母离子精确质量数、同位素丰度比和二级碎片离子等信息进行定性定量；4 种目标化合物的具体质谱分析数据见表1。目标化合物的质谱数据在使用Analyst TF 1.6 软件采集，数据在PeakView 2.0，MasterView 2.0 和MultiQuant 3.0 等软件上处理分析。

表1 4种化合物的质谱分析数据

2.2 待测化合物质谱碎裂途径分析

通过4 种化合物的二级碎片（见表2），可得知，在正模式+H 条件下，香兰素和乙基香兰素均具有m/z 93 的碎片，而其他化合物的碎片均没有重复。对4 种化合物的质谱碎裂途径进行分析，香兰素的主要碎片为[C7H9O2]+m/z 125 和[C6H5O]+m/z 93，碎片m/z 125 为香兰素丢失醛基形成，碎片m/z 93 为香兰素丢失醛基和甲氧基形成。甲基香兰素的主要碎片为[C8H11O2]+m/z 139 和[C7H9O]+m/z 124，碎片m/z 139为甲基香兰素丢失醛基形成，碎片m/z 124 为甲基香兰素丢失醛基和其中一个甲氧基形成。乙基香兰素的主要碎片为[C6H7O2]+m/z 111 和[C6H5O]+m/z 93，碎片m/z 111 为乙基香兰素丢失醛基和乙氧基丢失乙基后形成，碎片m/z 93 为乙基香兰素丢失醛基和乙氧基形成。香豆素的主要碎片为[C8H7]+m/z 103 和[C6H3O]+m/z 91，基峰为m/z 103，由苯并环上的碳氧键断裂和羰基位碳碳键断裂后形成。详细碎裂途径可见图1。

表2 4种化合物的二级质谱碎片

图1 4种化合物的质谱碎裂途径

2.3 方法条件的优化

2.3.1 流动相的选择和梯度的优化

实验前期分别对香兰素、香豆素、甲基香兰素、乙基香兰素的标准溶液进行正负离模式扫描，由于4 种化合物结构上含有O 原子，亲核性更强，所以正离子模式下，响应值均高于负模式。而在正模式下，流动相中加入甲酸，可为体系提供质子，使目标物形成更加稳定的准分子离子峰，响应更高。由于甲基香兰素和乙基香兰素是同分异构体，即使质谱也不能分别准确定量，因此需要调整色谱梯度，使其分离。在调整过程中发现，甲醇虽然和乙腈相比，洗脱能力较弱，但结果对比，保留时间变化并不明显，而使用乙腈为流动相，4 种化合物的峰型更加对称，因此选择乙腈作为流动相的有机相，通过调整洗脱梯度，4 种化合物在8 min 内达到良好分离。4 种化合物的提取离子流色谱图如图2。

图2 4种化合物的提取离子流色谱

2.3.2 固相萃取剂种类的选择

为了避免样品在测定过程中产生较大的基质效应，所以要对提取液进行净化，同时要避免固相萃取剂对目标物进行吸附。实验对比了PSA、GCB、C18和EMR 4 种固相萃取剂对香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素回收率的影响。结果表明，GCB 对4 种化合物吸附程度较高，而香兰素和乙基香兰素均具有酚羟基，同时含有O 原子，可能较易与PSA 中的胺基形成吸附作用力，因此回收率也较低。而C18 和EMR 除了能吸附提取液中的脂溶性杂质外，对目标物的吸附也较少，回收率较高，但EMR 的回收率要高于C18，因此，最终选择EMR 为净化用固相萃取剂，如图3所示。

图3 不同固相萃取剂对回收率的影响

2.3.3 EMR 用量的优化

初步确定使用EMR 为净化用固相萃取剂后，对EMR 的用量进行优化。由于奶粉中含有较多的油脂，使用EMR 净化能有较好的效果，在确保目标物回收率的情况下，EMR 用量越大，对基质效应消除的效果就越好。在净化提取液体积为10 mL 的情况下，使用了不同量的EMR 进行净化，结果表明，当EMR 用量为1 000 mg 的时候，4 种目标物的回收率较高，而用量继续增加，回收率上升不明显，因此，最终选择EMR 用量为1 000 mg。结果如图4所示。

图4 EMR用量对回收率的影响

2.4 基质效应的探究

由于奶粉中油脂较多，在测定的过程中，有可能会影响目标物的离子化程度，从而影响响应值。这种情况下若以纯溶剂曲线定量，会导致结果出现较大的偏差。因此，在仪器分析的过程中，若存在基质效应，则需要用基质曲线对定量结果进行校正。实验使用4种目标物呈阴性的奶粉，按样品处理方法1.3.2 进行处理，得到空白基质液后配制基质曲线。将基质曲线的斜率和纯溶剂曲线的斜率之比定义为基质效应（Ma⁃trix effect，ME），当ME 值在80%～120%之间时，则认为基质效应不明显，反之，则需要用基质曲线进行定量。而实验结果显示，4 种化合物的ME 值在55.8%～62.7%之间，因此，最终采用基质曲线进行定量。

2.5 线性关系和方法检出限、定量限

使用空白基质液稀释标准工作液，得到一系列质量浓度不同的基质标准溶液，在优化后的色谱及质谱条件下进样测定，以峰面积Y 为纵坐标，质量浓度X（μg/L）为横坐标进行绘图。对样品进行低浓度加标，分别按3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）计算检出限（LOD）和定量限（LOQ），4 种化合物的检出限为10.0～20.0 μg/kg，定量限为35.0～60.0 μg/kg，说明方法的灵敏度较高，可用于测定实际样品，见表3。

表3 4种化合物的定量参数

2.6 回收率与精密度实验

随机选择市售的奶粉按照前处理方法进行测定，选取阴性样品，进行加标回收实验。为了方便实验，以检出限较高的香兰素和香豆素为基准，选择其检出限的1倍、5倍和10倍水平进行添加。每个水平分别测定6次，并计算得出相对的相对标准偏差（RSD）。结果测得，香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的平均回收率在77.0%～94.4%之间，相对标准偏差为2.76%～4.77%，详见表4。表明方法回收率高，重现性好，能有效测定奶粉中的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素。

表4 奶粉中4种化合物的加标回收率（n=6）

2.7 方法的实际测定

为进一步考察所建立的方法是否能有效应用于实际样品的测定，随机选择了市售的检30 个奶粉样品，1 段15 个，2 段10 个，3 段5 个进行测定。30 个样品中香豆素和甲基香兰素均未检出，其中2 个1 段奶粉检出乙基香兰素（34.1 μg/kg 和133 μg/kg）和香兰素（66.2 μg/kg 和102 μg/kg），1 个3 段奶粉检出乙基香兰素（88.6 mg/kg）。分析认为应该是生产线污染带来，但对产品的质量安全仍存在较大的风险。

3 结论

采用乙腈对奶粉中的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素进行提取，提取过程高效简单；用EMR 对提取液进行净化，有效去除提取液中的油脂，降低了基质效应；结合超高效液相色谱，所有化合物在8 min 内出峰，且峰型良好，同时互为同分异构体的甲基香兰素、乙基香兰素也有较好的分离；使用高分辨质谱准确测定了目标物的精确分子量，提升了方法的整体定性能力，大大降低了假阳性的可能；用基质曲线进行定量，校正了基质效应，同时方法学数据表明，该方法回收率高，且选择性和灵敏度高，适用于奶粉中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素含量的分析检测，为乳制品的相关质量安全检测研究提供了参考依据。