弱后酸发酵剂菌株筛选及复配应用研究

冯丽莉，张栋，刘尧尧，李建磊，李艳娟，马蕊，贾洪利，王世杰

（1.石家庄君乐宝乳业有限公司，石家庄 050221；2.河北一然生物科技有限公司，石家庄 050800）

0 引言

酸奶是以生牛乳为主要原料，经过杀菌后在发酵剂的作用下保温发酵得到的凝固或非凝固状态的乳制品[1]。酸奶发酵剂是一种以乳酸菌为主要成份的微生物培养物。发酵剂的发酵特性主要包括产酸、产香、产黏等[2]，其中产酸是发酵剂最重要的发酵特性。但正常的发酵结束后，酸奶中的菌体持续产生乳酸引起产品pH 值降低，产生难以接受的过酸味，被称为后酸化（Postacidification）[3]。目前解决后酸化的措施主要为冷链运输[4-5]和添加乳酸链球菌素[6-7]等。但我国目前尚未形成完整的食品冷链体系且添加乳酸链球菌素易对酸奶产品品质产生影响并提高生产成本[8]。因此，控制酸奶后酸化的最佳途径是筛选能在发酵条件下快速产酸，在低温条件下产酸量较低的菌株[9-10]。所以，筛选具有优良特性的乳酸菌并进行发酵剂开发是生产优质酸奶的关键。

本研究旨在从自有菌库中筛选发酵特性优良的菌株，并将其通过合理配比得到一种整体发酵特性强、弱后酸化突出的的酸奶发酵剂。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料乳，石家庄君乐宝乳业有限公司；菌株，石家庄君乐宝乳业有限公司研发管理中心菌种资源库；MRS培养基，北京陆桥。

1.2 设备

电子天平，赛多利斯科学仪器；恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；超净工作台，上海新苗医疗器械制造有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，日本YAMATO；pH 计，梅特勒-托利多集团；pH 在线监测仪，法国ALLIANCE 公司；7890A—5975C 气相色谱质谱联用仪，美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵剂单菌株的筛选

实验前期，从石家庄君乐宝乳业有限公司菌种资源库（以下简称本公司菌种资源库）的800 余株菌种中挑选活力较好的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌共66株，初筛得到13 株优异菌株，分别活化后编号1～13，各按1% 的接种量接种于MRS液体培养基中，在37 ℃条件下培养48 h，将培养好的13 株菌株以转速3 500 r/min，4 ℃离心10 min，灭菌生理盐水清洗一次，分别用灭菌脱脂奶（灭菌条件：115 ℃，15 min）混匀，以10%接种量于37 ℃进行单菌株发酵，共发酵16 h。以pH值、酸度、黏度、活菌数、质构、凝乳发酵时间等指标为标准，筛选具备不同优良发酵特性的发酵菌株。

1.3.2 发酵剂菌株复配

将筛选得到的菌株按照不同的比例复配后发酵，共复配3 种配方，编号为I、II、III。取商业发酵剂作为对照组，编号为Ⅳ，将发酵剂I～Ⅳ分别进行中试发酵，发酵步骤为：分别称取鲜牛乳920 g、白砂糖75 g、其他辅料5 g，在水浴中加热搅拌使其充分融化，达65 ℃时，20 MPa 条件下均质，95 ℃灭菌10min，降温至42 ℃左右，接种发酵剂I～III（约10 g/kg），42 ℃发酵至pH 值为4.5 终止发酵，破乳后放入4 ℃冷藏24 h 后熟，召集感官评价17 名人员对其进行综合评价。整体口感喜好度用9 点强度标度法（9→1 表示喜欢→不喜欢，＜5 表示不被喜欢），其它感官特性用10 点强度标度法（10→0 表示极强→察觉不到）。采用此方法对上述发酵乳样品进行整体喜好度、香气、甜味、酸味、黏稠度、细腻度等指标评价[11]。

1.3.3 发酵剂产酸测定

将活化好的单菌株按1%接种量接种于MRS 液体培养基中，37 ℃条件下培养48 h，将培养好的菌株4 ℃，转速为3 500 r/min 离心10 min，灭菌生理盐水清洗一次，按筛选出的配方接种至灭菌脱脂奶混匀，采用pH 在线监测发酵剂在灭菌乳中的pH 值变化情况。

将发酵后的酸奶，在分别在4，15，30，37 ℃放置；分别取0，7，14，21，28 d 测定发酵乳的活菌数、pH 值、酸度。其中酸度的测定采用GB 5413.34-2010 中第二法进行[12]。计算公式如下：

式中：X2为试样的酸度（°T）；c2为氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/L）；V2为滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积（mL）；m2为试样的质量（g）；0.1 为酸度理论定义氢氧化钠的浓度（mol/L）。

1.3.4 发酵剂产香物质分析

采用SPME 固相微萃取方式对发酵样品进行产香物质分析，分别取酸奶样品7 mL，加入1 mL 饱和NaCl 溶液，60 ℃条件下用50/30 μm 的DVB/CAR/PDMS萃取头顶空恒温萃取30 min，然后再将萃取头在250 ℃进样口热解析5 min，进样，进行GC-MS解析。

（1）GC 条件。色谱柱：DB-WAX 聚乙二醇色谱柱；升温程序起始温度为35 ℃，保持6 min。然后以8 ℃/min的速率升至80 ℃，保持2 min。再以5 ℃/min的速度升至110 ℃，最后以10 ℃/min 的速率升至210 ℃，保留10 min；载气（He）流速1.0 mL/min；进样口温度：250 ℃。

（2）MS 条件。EI 离子源：电子轰击能量70 eV；离子源温度：230 ℃。

2 结果与分析

2.1 单菌株发酵特性分析

产酸速率是乳酸菌最关键的发酵特性[13]。在酸奶的工业化生产中，《GB 19302—2010 食品安全国家标准 发酵乳》对终产品的要求为酸度/（°T）≥70.0[14]，因此，产酸速度快、产酸量大是筛选发酵剂菌种的重要指标。表1 结果显示了自本公司菌种资源库筛选出的66 株自有菌株中，优选得到13 株，单菌株分别发酵16 h 后的不同pH 值。表中数据可以看出，菌株7的最终pH 最低，表明其在16 h 时间内产酸能力最强，而菌株13 的最终pH 值最高，在上述筛选菌株中产酸能力最弱。

酸奶的质构和风味也是判断乳酸菌发酵特性的重要标准[15-16]。表1 结果显示了13 株自有菌株单株发酵后的质构特性和风味香气特性，结果表明4、11 号菌株发酵后样品质构好，并有奶油香。12 号样品拉丝性强。13号后酸弱，口味清淡。

表1 单菌株发酵特性结果

通过各单菌株的发酵特性比较，筛选出产酸正常、质构较好、香气有特点的4 个单菌株，分别为第4，11，12，13号作为发酵剂的复配单菌株备用。

2.2 不同菌株组合发酵特性分析

将4 个单菌株进行不同比例组合发酵剂配方，组合发酵剂3 个，分别为：将上述配方复配发酵剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，感官评价结果显示，经复配发酵剂发酵制备的样品II 酸度最高、pH 值最低，表明在4 种复配发酵剂中，发酵剂II 的产酸能力最强，综合各项指标，对4 组发酵样品的整体评价为：Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅱ。各复配发酵剂发酵特性结果，见表2。

表2 各复配发酵剂发酵特性结果

9 点强度标度法对发酵样品的整体口感喜好度进行评价分析，数据分析用配对T 检验，图1 为整体喜好及各指标平均值的雷达图。由图1 可以看出，在5%显著性水平上，整体喜好度综合排序为Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅱ。3组样品的整体口感喜好度无显著性差异。这一结果表明，3 组发酵样品中，Ⅲ号发酵样品的整体喜好度偏高，香气最强，酸味和甜味适中，即Ⅲ号发酵剂的发酵效果最佳，适合用于制备口感、品质优良的发酵酸奶。

图1 复配发酵剂的感官评分

2.3 发酵剂产酸

筛选得到的Ⅲ号发酵剂命名为JLB-1510，取商业化发酵剂作为对照，利用两种发酵剂分别进行发酵，6 h左右后发酵达到pH＜4.5时停止发酵，将JLB-1510发酵得到的样品记为实验组，商业化发酵剂发酵得到的样品记为对照组。将发酵好的样品分别放置于4 ℃、15 ℃、室温和30 ℃环境，分别在发酵后20 h、2 d、3 d、5 d、7 d、11 d、15 d、19 d、21 d 检测其pH 值，发酵后2、3、5、7、11、15、19、21 d检测其酸度，共21 d。

通过21 天得到的阶段数据显示，在保质期内，实验组和对照组样品在pH、酸度、黏度指标上无显著差异，但具体结果显示：恒温4 ℃条件下，21 d 内实验组样品的pH 值始终高于对照组，除第5 天、第11 天以外，实验组样品的酸度之均低于对照组；恒温15 ℃条件下，21 d 内实验组样品的pH 值始终高于对照组，酸度值低于对照组；室温条件下，21 d 内实验组样品的pH 值始终高于对照组，除第15 天以外，其余时间实验组样品的酸度均低于对照组；恒温30 ℃条件下，第15天实验组pH 值低于对照组，其余均高于对照组，第5天实验组酸度高于对照组，其余均低于对照组。上述结果表明，在不同温度条件下，JLB-1510 发酵剂后酸较弱，能较好地保持发酵乳制品风味。

2.4 发酵乳香气物质分析

乳酸菌在发酵过程中会产生多种风味物质，主要包括乙醛、乙酸、乙偶姻、丙酮等[17-18]，这些物质作为挥发性有机芳香成分形成酸奶终产品的典型风味[19-20]。以JLB-1510 为1#，商业发酵剂为2#，分别中试发酵乳后，对两个中试样品的香气物质进行分析，实验结果见图3、表3。

表3 主要风味物质的峰面积响应值及香气描述

对比图3 中两个样品的色谱图，香气物质组成基本一致，都含有：醛酮类（乙醛、丁二酮、戊二酮、2-庚酮、乙偶姻），和挥发性的酸类（乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸）。对比峰面积的响应值，2#样品中醛酮类物质都要略高于1#样品，说明2#样品表现的奶油、黄油样的香气略强于1#样品；然而，1#样品中的己酸、癸酸和辛酸的响应值比2#样品偏高，说明1#样品表现出的油脂、奶酪样香气更为浓郁。总体而言，两个样品的香气物质构成一致，整体香气风味接近，但两个样品也略有微小差异，1#样品油脂、奶酪香更浓郁，2#样品奶油、黄油样香气更浓。

图3 香气物质分析

以上结果表明，由JLB-1510 发酵制备的1#样品与商业发酵剂发酵制备的2#样品香气物质构成一致，整体香气风味接近，但两个样品仍存在差异，其中1#样品油脂、奶酪香更浓郁，2#样品奶油、黄油样香气更浓。

图2 不同温度条件下发酵样品产酸情况

3 结论

本研究挖掘本公司菌种库种发酵性能优良的单菌株，并按其发酵特性进行不同比例的复配，开发了一种弱后酸化的酸奶发酵剂JLB-1510。本研究开发的发酵剂JLB-1510，发酵制备的酸奶香气清淡、感官评价结果良好，与传统商业化发酵剂制备的酸奶相比，能在4 ℃、15 ℃、常温、30 ℃不同的温度环境中，21 d 时间内维持较低的酸度和较高的pH 值，是一款发酵性能优良的弱后酸化酸奶发酵剂，可应用于发酵酸奶的工业化生产，并提高发酵乳的口感和品质。为解决我国冷链运输系统不完善，发酵酸奶的销售半径受限制[21]和酸奶发酵剂长期依赖于国外进口[22]的现状提供了实验数据。