MALDI-TOF MS与16S rDNA方法对乳酸菌鉴定分析比较

宋丹靓敏，陈晴，周梦瑶，张佳欣，程莎莎，方如雪，姜毓君，满朝新

（东北农业大学食品学院 乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

0 引言

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是一种软电离新型有机质谱技术，是检测和鉴定多肽、蛋白质的强有力工具[1]，目前已被用于微生物检测，其具有灵敏度高、准确度高和样品处理速度快等特点。由于微生物核糖体蛋白和外周蛋白具有特异性，其主要为遗传因素控制，培养环境、培养基成分等外部因素对其影响较小，通过基质辅助电离微生物蛋白质，可测得蛋白质和多肽的分子质量，形成独特的蛋白质片段组指纹图，通过特征性模式峰积累计算，从而实现对微生物的鉴定[2]。

目前，乳酸菌作为国内外常用的益生菌，在我国卫生部2010 年4 月公布的《可用于食品的菌种名单》中，包括6 种双歧杆菌、14 种乳杆菌、1 种链球菌，均属于乳酸菌[3]。由此可见乳酸菌有着十分重要的经济价值，但由于其属种较多，为更好的对其分类，使用快速、可靠的分类鉴定方法显得尤为重要[4]。但传统方法费时费力不适于大量乳酸菌的分类鉴定，然而随着分子技术的发展，一些方法如16S rDNA 序列分析[5]、脉冲场凝胶电泳（PFGE）[6]、限制性片段长度多态性分析（RFLP）[7]、扩增片段长度多态性分析（AFLP）[8]等已用于乳酸菌分类鉴定。而16S rDNA 基因具有高度保守性，因此难以区分具有较高遗传相似性的菌株，不能系统地研究其遗传变异及进化历程相关情况，故该方法更适用于属内物种之间的区分鉴别[9]。同时，该些方法，需要对于微生物DNA 提取并扩增后进行测序，导致其操作条件要求严格、花费时间较长以及费用较高的问题，极大限制了鉴定时效性，无法满足当今对于乳酸菌快速、廉价及高通量的鉴定要求。本研究以实验室所保藏以及由发酵乳制品中分离得到的15 株乳酸菌为研究对象，使用MALDI-TOF MS 以及16S rDNA 方法对其进行鉴定，并对该两种方法的系统归类学结果分析比较，以此评价MALDI-TOF MS方法用于乳酸菌鉴定及分类的准确程度。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

本试验研究所使用15 株乳酸菌菌株均由东北农业大学乳品重点工程实验室提供。其中12 株菌株分离自内蒙古传统发酵乳制品中，3 株参考菌株Lactoba⁃cillus casei ATCC 393，Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469，Lactobacillus plantarum ATCC 14917，均购于美国菌种保藏中心（ATCC）。

1.1.2 试剂与仪器

MRS培养基，北京索莱宝生物科技有限公司；细菌基因组DNA快速提取试剂盒，BioTeKe公司；三氟乙酸、无水乙醇购于津致远化学试剂有限公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）、乙腈、甲酸购于融智生物科技（青岛）有限公司；MasterMix购于日本TaKaRa公司。

BCN1360 型生物洁净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；Eppendorf 5810R 型低温冷冻离心机，上海艾研生物科技有限公司；DH-101 型恒温鼓风干燥箱，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；HH-s6 型电热恒温水浴锅，青岛聚创环保集团有限公司；MAL⁃DI-TOF MS 基质辅助激光解吸收电离-飞行时间质谱仪，融智生物科技（青岛）有限公司；Veriti 96-Well型PCR 扩增仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；DYY-8C 电泳仪，北京六一仪器厂；Cheimdox XRS型凝胶成像仪，美国Bio.Rad 公司；BioDrop 型超微量蛋白核酸分析仪，美谷分子仪器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株复苏与培养

将受试菌株按5 %接种量，接种于MRS 液体培养基，37 ℃培养18 h，复苏后接种于MRS 液体培养基，37 ℃培养24 h 后，于MRS 平板培养基中三区划线，37 ℃培养48 h，将第二代纯化单菌落分别用于MAL⁃DI-TOF MS鉴定检测及16S rRNA 测序分析。

1.2.2 MALDI-TOF MS样品前处理

使用1 μL 接种环挑取纯化后划线所得单个菌落，将微生物菌落涂在靶点中央位置，并摊涂均匀，形成薄层，使用移液器滴加2 μL 甲酸-乙腈溶液，待其自然晾干后，滴加1.5 μL CHCA 溶液，自然干燥备用。

1.2.3 MALDI-TOF MS采集条件

激光能量：5 uJ；激光频率：5 000 Hz；检测器电压：-0.56 kV；聚焦质量（Focus Mass）：10 000 u。

1.2.4 MALDI-TOF MS鉴定及分析

将采集到的数据导入QuanID DB 数据库与标准菌株的图谱进行比较，通过对比质荷比和特征峰得到微生物的鉴定结果；根据所收集得到的微生物蛋白质谱图数据，使用Cluster 3.0 软件中的聚类分析程序，对该15 株乳酸菌进行聚类分析，分析结果使用Tree⁃View 3软件制作树状图及热图。

1.2.5 乳酸菌16S rDNA 扩增

在1.5 mL 离心管中加入300 μL 已培养完成的乳酸菌，12 000 r/min离心5 min收集菌体，使用DNA快速抽提试剂盒提取的各菌株DNA，将提取后的菌株DNA 使用超微量蛋白核酸分析仪测定浓度。将所提取的DNA进行PCR扩增，正向引物为27F（5-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3），反向引物为1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR扩增体系为上游引物1 μL、下游引物1 μL、DNA模板5 μL、ddH2O 27 μL、Taq PCR Master mix 16 μL，总体积50 μL。PCR 扩增步骤：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，72 ℃保持10 min，循环30 次，4 ℃保温。待扩增反应完毕后，取2 μL 的PCR 产物用质量分数为1.5 %的琼脂糖凝胶电泳检测，若PCR 成功则在1 500 bp左右可见清晰的条带。

1.2.6 16S rDNA 测序及系统发育树构建

将经过琼脂糖凝胶电泳检测后的扩增产物送至北京擎科生物技术有限公司测序，将得到的序列使用DNAMAN 软件进行拼接及校准，将结果与NCBI 上GenBank 数据库中的已有序列进行BLAST（Basic Lo⁃cal Alignment Search Tool，http：//blast.ncbi.nlm.nih.Gov/Blast.cgi）进行同源性比对分析。运用MEGA 5.0软件，选取邻接法进行序列分析，构建菌株系统发育进化树[10]。

2 结果

2.1 乳酸菌DNA 提取及16S rDNA 扩增结果

使用超微量核酸蛋白分析仪对所提取的实验室所提供的15 株乳酸菌菌株DNA 浓度进行检测，测定浓度均在1.9 μg/mL 左右，达到要求PCR 扩增浓度要求。经PCR 扩增后，使用1.5 %的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，15 株乳酸菌菌株扩增结果如图1 所示，从图中可看出，在约1 500 bp 处可见清晰明亮的条带，且无非特异性扩增条带，表明扩增成功[11]。

图1 16S rDNA扩增产物电泳结果

2.2 MALDI-TOF MS与16S rDNA 鉴定结果比较

本研究所选用的15 株乳酸菌MALDI-TOF MS与16S DNA 鉴定结果比较列于表1。MALDI-TOF MS 对微生物鉴定为蛋白水平，对微生物的质谱前处理目的为促进微生物细胞破碎，使核糖体蛋白质析出。同时，由于微生物细胞破碎，胞内所含的糖类和脂类物质及其代谢产物亦会溶出，该些物质分子量低于3 000，其谱峰多为杂质峰，难以识别，故选用分子量在3 000～12 000的收集峰进行识别。

由表1 可知，使用MALDI-TOF MS 方法对于本实验室所保藏的15 株乳酸菌进行鉴定，经QuanID DB 数据库比对鉴定后，结果均为乳酸菌。其中乳杆菌属微生物11 株，双歧杆菌属微生物4 株，由此可见，MALDI-TOF MS 方法的鉴定水平均可至种水平级别，可有效对未知微生物属种名称进行识别。相比较16S rDNA 方法所得的鉴定结果，虽然两种鉴定方法鉴定的属级别水平一致，并对标准菌株均有一致的鉴定结果。但两种鉴定方法对于种水平鉴定结果存在偏差，表现为MALDI-TOF MS 对鉴定结果为类布氏乳杆菌（Lactobacillus parabuchneri），而16S rDNA 鉴定为布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）；MALDI-TOF MS鉴定结果为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei），而16S rDNA 鉴定结果为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）。

表1 15株乳酸菌MALDI-TOF MS与16S rDNA鉴定结果比较

图2 选取MALDI-TOF MS 与16S rDNA 两 者结果存在差异的NM-121-1 与鉴定结果一致的标准菌株ATCC393 质谱图进行比对，发现在m/z 7185.126、7943.827、9600.611 处存在显著性差异。而基于16S rDNA 方法区分Lactobacillus casei 与Lactobacillus paracasei通常存在误判，需通过recA基因序列进行辅助分析[12]。

图2 Lactobacillus casei ATCC 393与NM-121-1质谱图比较

16S rDNA 作为控制核糖体蛋白生成的一段保守序列，可用作微生物区别手段[13]，是目前可信度较高，应用较广的传统微生物鉴定手段。但在本试验中，种水平不一致鉴定结果的出现，表明使用16S rDNA 方法对于乳酸菌中亲缘关系较近的菌株及其亚种的鉴定区分能力存在一定偏差，出现该种结果的原因可能是由于种水平菌株与亚种菌株的核酸序列中碱基差异程度较小，整体序列相似度较高，其差异程度难以区分，导致其分类鉴别能力难度较高。而MAL⁃DI-TOF MS 方法针对于微生物细胞内整体的核糖体蛋白进行分析比对，再经数据库进行相关性比较，在数据量及分析能力上更突显优势，故可以更好地对于种水平菌株及其亚种进行更为精确的区分。

2.3 MALDI-TOF MS系统发育图谱

将通过MALDI-TOF MS 鉴定的15 株乳酸菌，使用各自全蛋白谱图数据，按照其质荷比及相对强度的相似性，进行聚类分析得到树状图及热图，如图3 所示。在图中，15 株乳酸菌均可归为同一个大类，这与MALDI-TOF MS 鉴定的所有菌株均属于乳酸菌的结果一致。同时，图3 直观地反映了15 株乳酸菌在蛋白水平的相关性和亲缘性，其中4 株双歧杆菌属微生物亲缘关系较近，归为一类；布氏乳杆菌与类布氏乳杆菌被归为一类，但干酪乳杆菌与副干酪乳杆菌被分为同一大类下的两个小类；加氏乳杆菌及嗜酸乳杆菌与其他菌株分类水平较远。以上结果的出现，表明MALDI-TOF MS 方法所得到的微生物全谱图数据，可较好的对乳酸菌进行聚类分析，并可通过聚类热图，在一定程度上明确不同种属水平菌株差异蛋白的所在，为进一步探讨菌株间的差异提供基础。

图3 15株乳酸菌的MALDI-TOF MS聚类分析图

2.4 16S rDNA 系统发育树构建

16S rDNA 邻近连接方法系统发育归类如图4 所示。该图反映了15 株乳酸菌在16S rDNA 水平下的亲缘关系与位置。双歧杆菌属4 株菌与乳杆菌属11株菌被分为两个大类。其中，布氏乳杆菌与类布氏乳杆菌相对偏差较小，被分为1 个分支；干酪乳杆菌与副干酪乳杆菌虽有一定偏差，亦被分为1 个分支；罗伊氏乳杆菌与其他乳杆菌差异较大，与其他乳杆菌分为2个分支。对比MALDI-TOF MS 聚类分析热图与16S rDNA 系统进化树，两者均可较好的将双歧杆菌属微生物及乳杆菌属微生物进行分类；但MAL⁃DI-TOF MS 聚类热图中显示干酪乳杆菌与副干酪乳杆菌的分类距离较远，表明使用MALDI-TOF MS 所得蛋白谱图数据进行聚类分析可有效区分，这与MALDI-TOF MS 与16S rDNA 对干酪乳杆菌与副干酪乳杆菌的鉴定结果一致，表明MALDI-TOF MS 可有效区分亲缘关系较近的菌株及其亚种，而16S rD⁃NA 方法对于种水平菌株及其亚种区分有一定缺陷。

图4 15株乳酸菌16S rDNA序列系统发育树

总体看来，在两种分类学方法计算下，15株乳酸菌的系统发育树及MALDI-TOF MS聚类热图存在一定差异，不同种属水平微生物的分之地位及下级分支有所不同。表明两种分类学方法对于乳酸菌相关分析有一定差异存在，但均适用于乳酸菌的亲缘关系分析。

3 结论

MALDI-TOF MS 作为一种新兴的软电离质谱技术，有着高通量、高灵敏度、低成本等优点，其前处理方法简便，鉴定结果获取时效快的特点，使得该技术广泛应用于微生物鉴定之中。其鉴定水平较高，可至微生物种属的水平。相比于16S rDNA 方法，MAL⁃DI-TOF MS 基于微生物外周蛋白和核糖体蛋白的差异对于不同种属水平微生物进行鉴别，仅需将固体培养基中单菌落涂抹至靶板，经前处理操作后即可得出结果，省略了纯化及DNA 提取的步骤，极大缩短了微生物鉴定的时间，以乳酸菌为例，可提前约12～18 h 得出鉴定结果。对于基因型相近的乳酸菌，如干酪乳杆菌与副干酪乳杆菌，相比于16S rDNA 方法，MAL⁃DI-TOF MS 基于细菌表达的蛋白指纹进行鉴定，可显示出更精确的区分。虽然MALDI-TOF MS 方法对于微生物鉴定结果准确率较高，但其蛋白质标识峰归类法与16S rDNA 所用的基因学方法对于乳酸菌归类仍有差异。整体说来，MALDI-TOF MS 可作为一种快速、简便、高效率的微生物鉴定技术，应用于多个领域之中。