外周血NK细胞培养的扩增效率及杀伤活性的变化趋势

阳 莉， 胡 元， 陈晓燕 ，黄梦淳，卢建溪⋆

（1.中山大学附属第三医院生物治疗中心，广东 广州 510000；2.东莞长安港湾医院内科 ，广东 东莞 523000）

免疫疗法作为继手术、化疗和放疗之后治疗恶性肿瘤的第四种方法，近年来正在快速发展并受到广泛关注。目前，临床上使用的免疫疗法包括免疫检查点阻断剂疗法、细胞因子疗法、分子靶向疗法和过继免疫疗法等[1-3]。过继免疫疗法又叫免疫细胞疗法，是指取患者自体淋巴细胞或免疫力强的健康供者的淋巴细胞，经体外活化、扩增后，再回输至患者体内以发挥抗肿瘤作用的一种治疗手段。自然杀伤（natural killer，NK）细胞是人体内重要的免疫细胞，负责杀伤老化细胞、感染病毒的细胞、肿瘤细胞等异常细胞。NK 细胞的这种天然杀伤活性无需抗原致敏，且无主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）限制性，能自动识别并攻击受病毒感染的细胞、肿瘤细胞等异常细胞。NK细胞由于其独特的抗肿瘤特点，在肿瘤免疫治疗中的作用越来越受到重视[4-8]。人体外周血中NK 细胞的数量较少，且肿瘤患者体内NK 细胞的活性较低，故需要在体外活化和扩增NK 细胞，使其达到一定数量后再回输至患者体内，这样才能发挥更好的抗肿瘤作用。本研究主要是探讨NK 细胞在体外培养过程中细胞数量、免疫表型及杀伤活性的变化趋势。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主 要 仪 器 与 试 剂 ALYS505NK-AC 培 养 液 和ALYS505NK-EX 培养液（由日本CSTI 公司生产），重组人白细胞介素-2（由山东泉港药业生产），人淋巴细胞分离液（由挪威Axis-shield 公司生产），赫赛汀（由美国Roche 公司生产），淋巴细胞检测试剂盒CD45/CD56/CD19/CD3（由美国Beckman Coulter 公司生产），K562 细胞株（本实验室保存），细胞培养袋（由日本Takara 公司生产），倒置显微镜（由日本Nikon 公司生产），CytoFLEX 流式细胞分析仪（由美国Beckman Coulter 公司生产），Centrifuge 5810R 离心机（由德国Eppendorf公司生产），240i 二氧化碳培养箱（由美国Thermo Scientific 公司生产）。

1.1.2 实验对象 采用本中心的NK 细胞无血清培养基，分别对10 份健康人的外周血进行NK 细胞扩增培养，并在培养过程中对相关指标进行检测。

1.2 方法

1.2.1 外周血NK 细胞的培养 采用无血清培养法对外周血NK 细胞进行扩增培养，方法是：采用密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs），用ALYS505NK-AC 培养液对PBMCs 进行重悬处理，将细胞密度调整至（1 ～3）×106/mL后装入预先用赫赛汀包被好的培养瓶中，并置于37℃、二氧化碳体积分数为5%、饱和湿度的培养箱中进行培养。每隔3 d 用ALYS505NK-EX 培养液对细胞进行补液。

1.2.2 外周血NK 细胞的细胞计数、表型分析及杀伤活性检测 分别在培养的第0 天、第4 天、第8 天、第12天、第16 天和第20 天对培养标本进行取样，进行细胞计数和存活率的测定，并用淋巴细胞检测试剂盒CD45/CD56/CD19/CD3 在流式细胞仪上测定外周血NK（CD3-CD56+）细胞和NKT（CD3+CD56+）细胞的比例。采用台盼蓝染色法对NK 细胞进行活细胞计数并计算细胞的存活率。采用CFSE/PI 双染法检测NK 细胞的杀伤活性，具体步骤是：1）标记靶细胞。将K562 细胞浓度调整为1.0×106/mL，加入荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰 亚 胺 酯（carboxyfluorescein diacetate n-succinimidyl ester，CFSE）对靶细胞进行标记，在37 ℃下避光染色20 min。加入5 倍体积预冷的含10% 胎牛血清的RPMI1640 培养液，冰浴5 min，终止染色，调整细胞浓度至1.0×105/mL。2）共培养。加入1.0×106/mL 的NK细胞作为效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例为10:1，同时设靶细胞自然凋亡对照孔，在250 g 的离心力下离心5 min 后置于37℃、二氧化碳体积分数为5%、饱和湿度的培养箱中孵育4 h。3）标记细胞。采用荧光染料碘化丙啶（propidium iodide，PI）标记死亡细胞，在24℃下避光染色30 min 后用生理盐水洗去未结合的染料。4）上机检测及分析。采用CytoFLEX 流式细胞仪对外周血NK 细胞进行检测及数据分析。计算公式：靶细胞的杀伤率=（靶细胞的死亡率-靶细胞的自然凋亡率）/（100- 靶细胞的自然凋亡率）×100%。

1.3 统计学方法

用GraphPad Prism 6 统计软件处理本研究中的数据，重复测量资料用±s表示，采用重复测量资料方差分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血NK 细胞的形态学观察

在培养的第2 天～第3 天，培养基中开始形成细胞集落，随着培养时间的延长，细胞集落逐渐变大，数量也随之增多，肉眼可见许多小颗粒悬浮物，在显微镜下可见这些小颗粒悬浮物为悬浮生长的细胞克隆团。

2.2 外周血NK 细胞的免疫表型变化

采用流式细胞技术进行检测的结果显示，随着培养时间的延长，外周血NK 细胞中CD3-CD56++细胞和CD3+CD56+细胞的有效细胞数量逐渐增加，至第16 天后出现下降的趋势。不同培养时间点（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 细胞中CD3-CD56++细胞和CD3+CD56+细胞的比例相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见图1、图3、表1。

图1 不同培养时间NK 细胞的比例

2.3 外周血NK 细胞的扩增效率和杀伤活性

在培养的第8 天～第20 天（快速增殖期），不同培养时间点（第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 细胞的存活率均＞95%。细胞总数由培养初始的（1.15e×107±0.10×107）个，至第20 天达到了（4.78×109±1.63×109）个，扩增了（602.20±210.70）倍。不同时间点（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 细胞的扩增倍数相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。在效靶细胞比例为10:1、孵育4 h 的条件下，检测各时间点外周血NK 细胞的杀伤活性发现，不同培养时间点（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 细胞的杀伤活性相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见图2、表1。

图2 不同培养时间外周血NK 细胞的杀伤活性

2.4 外周血NK 细胞扩增效率及杀伤活性的变化趋势

随着培养时间的延长，外周血中NK 细胞的数量逐渐增加，不同培养时间点（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 细胞的数量相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；NK 细胞的杀伤活性从培养第8 天开始升高，至第12 天达到峰值后开始下降，不同培养时间点（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 细胞的杀伤活性相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；NK 细胞的比例先增加后下降（培养至16 d 达到峰值后开始下降），其比例的下降趋势较杀伤活性的下降趋势滞后。不同培养时间点（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 细胞的比例相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1、图3。综合考虑外周血NK 细胞的存活率、细胞数量、细胞比例和杀伤活性等因素，发现培养第12 天～第16天外周血NK 细胞的综合质量较优，此时间段为患者回输NK 细胞较为合适。

表1 不同培养时间外周血NK 细胞的扩增效率、比例和杀伤活性（n=10，± s）

表1 不同培养时间外周血NK 细胞的扩增效率、比例和杀伤活性（n=10，± s）

注：10:1 指效靶细胞比例为10:1，4 h 指孵育时间为4 h。

指标 第4 天 第8 天 第12 天 第16 天 第20 天 F 值 P 值数量（×108） 0.58±0.19 3.74±1.15 12.59±3.19 24.62±6.23 47.77±16.28 8.236 0.025扩增倍数 5.35±1.63 48.31±16.09 155.10±37.36 293.90±63.27 602.20±210.70 6.503 0.041 CD56+细胞的数量（%） 47.25±3.27 61.76±2.74 70.07±3.23 73.20±4.90 65.69±6.60 31.170 ＜0.001杀伤活性（%）（10:1，4 h） 16.95±4.24 25.26±5.63 34.21±4.59 28.07±3.27 24.50±3.21 6.587 0.010

3 讨论

NK 细胞可通过释放颗粒酶和穿孔素等杀伤性介质及分泌大量细胞因子直接攻击靶细胞，或通过抗体依赖的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞，或通过诱导Fas/Fasl 和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosisinducing ligand，TRAIL）分子使靶细胞凋亡，进而可起到抗肿瘤的作用[9]。通常情况下，人体内NK 细胞的生存周期较短，一个成年人体内约含有2×109个NK 细胞[10]。通过向恶性肿瘤患者体内输注经体外活化扩增的NK 细胞，可使其体内NK 细胞的数量提升约两倍。本研究优化了NK 细胞的体外活化扩增方案，建立了一种NK细胞无血清培养方法，在培养基中只需将白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）的浓度维持在1000 IU/mL，经过约两周的培养就可使总细胞数达到约600 倍的扩增，其中NK 细胞的比例高达80%。此方法虽然在扩增效率及提取纯度方面低于滋养细胞培养法，但能满足临床使用的要求，且安全性较高。目前，临床常用的NK 细胞培养时间一般为14 d 左右[4]。随着培养时间的延长，虽然NK 细胞的数量会不断增加，但细胞的杀伤活性会逐渐下降，因此并不是培养时间越长越好。NK 细胞在临床使用的过程中，受患者自身状态、医学检查、用药或接受其他治疗等因素的影响，经常会出现细胞回输时间需要提前或推后的情况。为了使患者达到最佳的治疗效果，本文深入研究了外周血中NK 细胞数量、比例和杀伤活性的变化趋势，明确了NK 细胞临床应用的时间窗。

综上所述，采用无血清培养法对外周血NK 细胞进行培养时，随着培养时间的延长，外周血NK 细胞的数量呈逐渐增加的趋势。外周血NK 细胞的杀伤活性在培养12 d 后出现下降的趋势。在培养的第12 天～第16 天，NK 细胞的杀伤活性较强，细胞数量较多，细胞纯度较高，此阶段细胞的质量较好，是临床应用的最佳时期。采用无血清培养法体外扩增NK 细胞的效率较高。