基于网络药理学的鸡血藤抗肝纤维化机制研究▲

黄菊芳 蒋云霞 黎敏航 罗 婷 罗伟生

(1 广西中医药大学附属瑞康医院消化内科，南宁市 530011，电子邮箱：huang18376785146@163.com；2 广西中医药大学研究生学院，南宁市 530001)

肝纤维化是在病毒性肝炎、乙醇、自身免疫以及药物等各种致病因子作用下引起的肝内慢性损伤和炎症[1]，可导致细胞外基质在肝脏内过度沉积，是各种慢性肝病发展的病理特征。肝纤维化的发展具有隐匿性，有效控制肝纤维化对预防肝硬化和肝癌具有重要作用。然而当前临床上仍然缺乏高效且无明显毒副作用的抗肝纤维化西药专药，故从中医药宝库中寻找有效抗肝纤维化的药物具有重要的意义。

鸡血藤为豆科木质藤本植物密花豆的干燥藤茎，记载于《本草纲目拾遗》，其性苦、甘、温，归肝、肾两经，具有活血补血，调经止痛，舒筋活络功效[2]。研究表明，鸡血藤具有抗氧化、降血脂、保护肝细胞、抗病毒等作用[3-5]，但是目前有关鸡血藤用于抗肝纤维化的研究较少，且抗肝纤维化的分子作用机制尚不明确。本文拟采用网络药理学探讨鸡血藤抗肝纤维化的作用机制。

1 资料和方法

1.1 筛选鸡血藤的活性成分 借助中药系统药理学数据库与分析平台(https://tcmspw.com/tcmsp.php)检索鸡血藤的所有化学成分，然后以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、药物相似性(drug likeness，DL)≥0.18作为筛选条件[6]，筛选鸡血藤中的活性成分。然后利用 Perl 软 件(https://www.perl.org/)对筛选出的活性成分的靶点进行预测。

1.2 注释鸡血藤的靶点基因 针对1.1中筛选出的靶点，利用UniProt在线蛋白质数据库(https://www.uniprot.org/)查找对应的标准靶点基因名，从而对鸡血藤的靶点基因进行注释，删除UniProt数据库中未查询到基因名的靶点。

1.3 筛选鸡血藤作用于肝纤维化的有效靶点 以“Liver fibrosis”为检索词，通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和OMIM数据库(https://www.genecards.org/)检索疾病靶点，从而得到肝纤维化的疾病靶点。利用微生信网站(http://www.bioinformatics.com.cn/)构建韦恩图，从而将疾病靶点与筛选出来的鸡血藤活性成分靶点进行比对并取交集，最终获得鸡血藤作用于肝纤维化的潜在作用靶点。

1.4 构建药物-疾病靶点网络 通过Cytoscape 3.7.0软件构建鸡血藤活性成分-肝纤维化靶点网络，运用Cytoscape插件Network Analyzer计算网络的拓扑参数，设置节点的形状、大小以及颜色透明度，根据节点和节点之间的作用强度调节边的粗细，并得到网络分析结果。

1.5 构建鸡血藤作用于肝纤维化的有效靶点的蛋白-蛋白互作网络 将鸡血藤作用于肝纤维化的有效靶点导入在线软件STRING 11.0，设定研究物种为“homo sapiens”，下载“string_interactions.tsv”文件，并将信息导入Cytoscape 3.7.0软件进行可视化分析处理，构建蛋白-蛋白互作(protein-protein,interaction,PPI)网络图。其中，度值(Degree)反映节点的中心属性，即靶点的颜色越深、面积越大，则度值越高；连线的粗细表示节点与节点之间的相互作用，线条越粗则代表节点之间的关系越密切。

1.6 基因功能和通路富集分析 利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/，Version 6.8)，针对鸡血藤作用于肝纤维化的有效靶点进行基因本体论(Gene Ontology,GO)生物学功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,根据P≤0.01筛选出前10名GO生物学功能和KEGG通路。利用R语言软件构建KEGG通路分析的柱状图。

2 结 果

2.1 鸡血藤的主要活性成分 共搜索到鸡血藤有效成分68个，相关靶点1 142个。根据OB≥30%、DL≥0.18的标准去重筛选，共获得主要活性成分24个，对应的靶点56个。见表1。

表1 鸡血藤的主要活性成分

2.2 鸡血藤作用于肝纤维化的有效靶点 基于GeneCards和OMIM数据库，通过筛选去重得到肝纤维化的疾病靶点共6 899个，将鸡血藤主要活性成分的靶点与肝纤维化的疾病靶点取交集，获得共同的靶点49个(见图1)，包括孕激素受体(progesterone receptor,PGR)、毒蕈碱胆碱能受体(cholinergic receptor muscarinic,CHRM)3、CHRM1、CHRM2、γ-氨基丁酸A型受体α1亚单位(gamma-aminobutyric acid type A receptor subunit alpha 1,GABRA1)、乙醇脱氢酶1B(Ⅰ类)β多肽[alcohol dehydrogenase 1B(classⅠ),beta polypeptide,ADH1B]、前列腺素内过氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)、肾上腺素受体α1A(adrenoceptor alpha 1A,ADRA1A)等靶点。

图1 鸡血藤-肝纤维化共同靶点的韦恩图

2.3 药物-疾病靶点网络 将24个鸡血藤有效活性成分以及49个鸡血藤作用于肝纤维化的有效靶点，构建药物-疾病靶点网络(见图2)。该网络中共有74个节点通过219条边发生作用，其中包括23个鸡血藤主要活性成分节点(蓝色箭头)和49个肝纤维化的疾病靶点基因节点(紫色圆形)、疾病(橘色四边形)、中药(紫色三角形)。

图2 鸡血藤活性成分-肝纤维化疾病靶点网络图

2.4 蛋白互作网络与核心基因筛选结果 将鸡血藤有效活性成分作用于肝纤维化的靶点导入在线软件STRING 11.0，获取蛋白互作数据，并利用Cytoscape 3.7.0软件根据度值的大小进行排列，构建PPI网络(见图3)，此网络共有48个节点(鸡血藤作用于肝纤维化的有效靶点)通过319条边进行相互作用。其中，鸡血藤抗肝纤维化的潜在靶点度值排前5的靶点依次为表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)、癌组基因(MYC)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、雌激素受体(estrogen receptor,ESR)1和血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)。利用Cytoscape软件分析插件Node Degree Distribution，对鸡血藤对肝纤维化作用靶点的PPI网络进行拓扑学分析，取靶点度值前30的靶点，见表2。

图3 PPI网络图

表2 PPI网络拓扑学分析结果(Degree排前30的靶点)

2.5 鸡血藤作用于肝纤维化的生物信息学分析 GO功能富集分析结果提示，鸡血藤作用于肝纤维化的有效靶点参与了154个生物学过程,包括凋亡过程负调控、细胞对缺氧的反应、细胞增殖等；23个细胞成分，包括细胞核、突触、核浆、细胞质等；46个分子功能，包括类固醇激素受体活性、类固醇结合、半胱氨酸型内肽酶活性与细胞凋亡的关系等。见表3。

表3 鸡血藤对肝纤维化作用靶点的GO分析

共分析出101条信号转导通路，前20条通路见图4，其中包括前列腺癌信号通路、人类巨细胞病毒感染信号通路、乙型肝炎信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信号通路、EB病毒感染信号通路、膀胱癌信号通路等。

图4 KEGG通路分析柱状图

3 讨 论

肝纤维化是多种慢性肝脏疾病的共同表现，是肝硬化以及肝癌必经的中间环节，严重危害人类健康。研究表明，中医药在预防和抗肝纤维化中起到了一定的成效，单味中药的提取物如莪术醇[7]、姜黄素[8]、川芎嗪[9]等都可通过不同的靶点或信号通路抑制肝纤维化的发生和发展。研究表明，从鸡血藤中可提取到黄酮类、酚酸、香豆素、木脂素、萜、生物碱和甾体等活性成分[10-11]，这些活性成分可通过促进肝肿瘤细胞凋亡[12]、抑制氧化应激[13]起到保护肝脏的作用。但是目前有关鸡血藤抗肝纤维化作用的研究较少，且鸡血藤含有多种活性成分，其抗肝纤维化的主要成分及抗肝纤维化的作用机制尚不完全明确。本研究利用网络药理学对鸡血藤抗肝纤维化的作用机制进行探讨，以期阐释鸡血藤防治肝纤维化的主要成分及其作用靶点，为寻找和开发抗肝纤维化的药物提供参考。

本研究通过网络药理学分析，得出鸡血藤的主要活性成分24个和潜在的抗肝纤维化靶点49个；PPI网络中度值排前5位的靶点依次为EGFR、MYC、IL-6、ESR1和VEGFA，其与其他靶点发生的相互作用最多，提示这5个靶点是鸡血藤抗肝纤维化的有效潜在靶点。研究表明，细胞因子通过刺激肝星状细胞的活化和增生，抑制细胞外基质的降解，导致肝纤维化进一步发展[14]。其中，表皮生长因子受体属于受体酪氨酸激酶的ErbB家族，在上皮细胞生理学中发挥关键作用，是上皮生长因子细胞增殖和信号传导的受体[15]。EGFR的表达升高与肝组织损伤和炎症反应延长有密切的联系[16]，并参与肝纤维化的形成和发展[17]。MYC基因包括C-myc、N-myc、L-myc 3个家族成员[18]，C-myc在肝细胞中会诱导肝星状细胞的激活，促进成肌纤维细胞分化增殖[19]，是慢性肝脏疾病的驱动力[20]，可导致肝纤维化甚至肝硬化和肝肿瘤发生。鸡血藤的有效活性成分可能主要通过调节上述肝细胞有害因子以及肝组织炎症反应(细胞因子)等来抑制肝纤维化的进展。目前，尚无文献报告IL-6、ESR1、VEGFA与肝纤维化的关系。

通过GO富集分析发现，鸡血藤抗肝纤维化潜在的靶点主要参与凋亡过程负调控、细胞对缺氧的反应、细胞增殖等生物学过程，涉及细胞质、突触、核浆、细胞核等细胞成分，以及类固醇激素受体活性、类固醇结合、半胱氨酸型内肽酶活性与细胞凋亡的关系等分子功能；这些靶点可通过影响甾体激素受体活性、泛素样蛋白连接酶结合、核受体的活性、乙酰胆碱受体的活性、泛素蛋白连接酶结合、突触后神经递质受体活性、DNA结合转录因子的结合等过程来调控肝纤维化的发生和发展。

KEGG通路分析结果显示，鸡血藤抗肝纤维化潜在的靶点涉及的信号通路主要包括前列腺癌信号通路、人类巨细胞病毒感染信号通路、乙型肝炎信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、PI3K/Akt信号通路、EB病毒感染信号通路、膀胱癌信号通路等。其中，中医药可通过调节PI3K/Akt途径在肝纤维化发展中发挥重要作用[21]。Lei等[22]发现，下调PI3K/Akt/mTOR信号通路，可促进细胞外基质的降解，减轻肝实质损害，实现肝纤维化的逆转。EB病毒也称为人类疱疹病毒，是一种普遍存在的传染性病原体，全球每年约有98%的人口被EB病毒感染[23]，而EB病毒是引起肝损伤甚至肝功能衰竭的病原体[24]，可诱发自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化等疾病[25]。肝细胞持续损伤可导致肝硬化，而肝纤维化是肝硬化必经的中间环节。

本研究基于网络药理学探讨鸡血藤抗肝纤维化的作用机制，发现鸡血藤中的多种有效成分可作用于多种靶点和信号通路从而发挥抗肝纤维化的作用。但是，肝纤维化的病因多种多样,发病机制复杂,细胞外基质及肝内各种细胞均参与了肝纤维化的发生、发展,并且受限于各种数据库、文献信息的更新不全，基于网络药理学对于鸡血藤抗肝纤维化的认识还存在一定的局限性。如何进一步阐明细胞外基质与细胞之间、细胞与细胞之间的相互关系,尤其是中医药在肝纤维化中的作用机制,为肝纤维化治疗寻找特异性靶点,可能是今后研究的热点和难点。