槲皮素对多囊卵巢综合征大鼠氧化应激状态的改善作用▲

杨 哲 胡 雪 吴庚香

(1 武汉大学人民医院生殖医学中心，湖北省武汉市 430060，电子邮箱：1395210785@qq.com；2 湖北省十堰市太和医院生殖医学中心，十堰市 442000)

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是女性常见的内分泌和代谢异常疾病[1]，影响着5%～20%的育龄妇女以及绝经前妇女[2]，然而其病因以及发病机制至今仍未完全阐明。研究表明，PCOS患者体内存在不同程度的氧化与抗氧化失衡[3-4]。槲皮素是膳食中最丰富的类黄酮之一。近年来有研究显示槲皮素具有出色的抗氧化性能，包括抑制氧化呼吸链的扩散和清除自由基[5]。本研究应用槲皮素对PCOS大鼠进行干预并观察大鼠体内氧化应激相关指标水平的变化，探讨槲皮素是否可改善PCOS大鼠体内的氧化应激状态。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 21日龄未成年雌性SD大鼠30只(体重80～90 g)，购自武汉大学实验动物中心[许可证号：SYXK(鄂)2015-0027]。按照随机数字表法将大鼠分为正常对照组、PCOS组以及PCOS+槲皮素组，每组10只，各组大鼠分笼编号喂养。

1.2 主要试剂及药物 睾酮、雌激素、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司(批号：E-EL-0072c、CSB-E05110r、CSB-E06869r、CSB-E12654r)；一氧化氮、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛ELISA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所(批号：A013-2、A014-2、A003-1、A001-1)；脱氢表雄酮购自阿拉丁试剂有限公司(批号：D106380)；槲皮素购自美国Sigma公司(批号：Q4951)。

1.3 动物模型的构建及标本的获取 参考本课题组前期发表的文献[6]，构建SD大鼠PCOS动物模型，方法如下：所有大鼠均于21日龄断乳，进食普通饲料，自由饮水，适应性喂养2 d。自23日龄起，于每日同一时间，给予PCOS组以及PCOS+槲皮素组大鼠颈部皮下注射脱氢表雄酮，剂量为6 mg/100 g(脱氢表雄酮用0.2 mL橄榄油溶解)，正常对照组大鼠每日给予颈部皮下注射等量橄榄油，3组均持续注射20 d。末次给药后，于次日早8：00，给予PCOS+槲皮素组大鼠灌胃槲皮素100 mg/kg(槲皮素溶于2 mL羧甲基纤维素溶液)，间隔4 h再次给予同样剂量药物，PCOS组及正常对照组灌胃等量不含槲皮素的羟甲基纤维素。第2日晨所有大鼠吸入异氟烷麻醉后，下腔静脉采血10 mL，经3 000 r/min，离心10 min后取上清，分装保存于-80℃冰箱。取卵巢组织，并经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色，镜下观察组织的病理变化。

1.4 血清性激素水平的测定 按照ELISA试剂盒说明书检测血清睾酮、雌激素、FSH、LH水平。主要步骤如下：使用缓冲液稀释抗体后加入酶标板，4℃下保存过夜进行包被，次日每孔加入封闭液进行洗涤，添加稀释后的待检样品于包被完成的酶标板的反应孔中，同时做空白孔和标准品孔。添加完成后封板并置于37℃暖箱中孵育1～2 h。孵育完成后各孔加入生物素化抗体工作液，37℃孵育1 h，洗涤后加酶结合物工作液于37℃避光孵育30 min，再加入3，3′，5，5′-四甲基联苯胺底物于37℃避光反应10～30 min，最后加入2 mol/L硫酸终止反应。在酶标仪(PerkinElmer公司，型号：HH3400)上于450 nm波长处测各孔吸光度值，绘制标准曲线，计算样本浓度。

1.5 血清氧化应激相关分子水平的测定 根据相应试剂盒说明书的步骤检测一氧化氮、NOS、SOD、丙二醛水平。方法基本同上述ELISA的步骤，并设空白孔、标准孔、待测样品孔。

1.6 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行数据处理和统计分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，不符合正态分布的资料以[M(P25,P75)]表示,符合正态分布且方差齐的数据比较采用单因素方差分析(多重比较采用LSD-t检验)，否则组间比较采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠的卵巢组织学变化 正常对照组大鼠卵巢体积正常，镜下可观察到正常的各级卵泡及黄体。PCOS组及PCOS+槲皮素组大鼠卵巢表面均较苍白，体积较正常对照组大，有较多囊状卵泡，两组组织病理学无明显差异；镜下见两组卵巢内存在较多扩张卵泡，呈现出多囊样改变，颗粒细胞层变薄，卵泡膜细胞增生，卵泡内未见放射冠以及卵母细胞，黄体少见。见图1。

图1 3组大鼠卵巢组织镜下观(HE染色，×100)

2.2 3组大鼠血清性激素水平的比较 与正常对照组相比，PCOS组和PCOS+槲皮素组的血清睾酮水平升高(P<0.05)，但PCOS组与PCOS+槲皮素组的血清睾酮水平差异无统计学意义(P>0.05)。3组间雌二醇、FSH、LH水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 3组大鼠血清性激素水平的比较

2.3 3组大鼠血清氧化应激指标浓度的比较 与正常对照组相比，PCOS组大鼠血清SOD浓度降低，丙二醛浓度升高(P<0.05),一氧化氮及NOS浓度虽有升高，但差异无统计学意义(均P>0.05)；PCOS+槲皮素组以上指标与正常对照组比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。与PCOS组相比，PCOS+槲皮素组的血清SOD浓度升高，一氧化氮、丙二醛浓度降低(均P<0.05)，而NOS浓度亦有轻度下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 3组大鼠血清氧化应激指标的比较

3 讨 论

PCOS患者的卵巢体积增大、外膜增厚，镜下可观察到不成熟状态下囊性扩张的卵泡，并且大多数患者伴有雄激素水平的增高。本研究采用脱氢表雄酮诱导的PCOS大鼠不管是卵巢的病理组织改变还是激素水平的变化都与PCOS患者高度相似，与既往文献报告的结果[1]相似。

研究表明，氧化应激可能参与PCOS发病的病理生理过程[7]。Murri等[4]的Meta分析结果表明，PCOS女性体内的氧化应激循环标志物异常，且与体重超重无关。SOD是抗氧化酶系的重要组成部分，具有抗氧化作用；丙二醛是自由基作用于脂质发生过氧化反应产生的终产物，能够反映细胞膜受氧化应激损伤的程度；一氧化氮是一种活性氮，通过参与传递电子参与机体的氧化还原过程。本研究结果显示，PCOS大鼠血清SOD浓度降低，丙二醛浓度升高(P<0.05)，同时一氧化氮及NOS水平有升高趋势，与既往研究结果[8]相似，这提示PCOS大鼠体内存在异常的氧化应激状态。

槲皮素是一种被广泛研究的类黄酮物质，在植物性食品中使用最为广泛。槲皮素以其在自由基清除和抗过敏特性方面的抗氧化活性而著称[5]。既往研究已经证实，槲皮素可以通过调节体内谷胱甘肽的含量、氧化应激相关酶的活性及氧化应激信号传导通路来发挥抗氧化活性[9]。槲皮素因其显著的抗氧化能力已经在肝脏疾病、心血管系统疾病、恶性细胞转化、神经元变性等领域发挥重要作用。还有研究表明，槲皮素能够通过抑制还原型辅酶Ⅱ的活性，来平衡活性氧水平并提高抗氧化活性，从而逆转PCOS大鼠血清SOD以及丙二醛等血清氧化应激指标的水平[10]。本研究中，PCOS大鼠经槲皮素处理后SOD浓度较PCOS组升高，一氧化氮、丙二醛浓度降低(P<0.05)，而NOS浓度亦有轻度下降，且上述氧化应激指标与正常对照组接近，说明槲皮素可较好地改善PCOS大鼠体内的氧化应激状态。

然而，本研究中经槲皮素治疗的PCOS大鼠其卵巢形态及血清雄激素水平均较PCOS组无明显改变，这可能与给药时间较短有关。有研究显示，经槲皮素100 mg/kg持续治疗28 d后，PCOS大鼠卵巢形态、卵泡形成以及卵泡囊性扩张程度相对于未处理的PCOS大鼠有所改善[10]；Jahan等[11]报告用槲皮素30 mg/kg持续治疗22 d后，PCOS大鼠卵巢直径以及囊性卵泡直径显著缩小，且睾酮及LH水平降低。本研究中槲皮素的使用剂量是100 mg/kg，但两次给药只间隔4 h，用药时间较短，但是即使是在如此短时间内给药，槲皮素仍能使PCOS大鼠血清FSH的水平较正常对照组水平有所升高，LH浓度有所下降。因此，槲皮素在改变PCOS大鼠异常的性激素水平方面显示了较好的潜能，适当延长槲皮素的给药时间，其对性激素、卵巢形态以及氧化应激状态的改善效果可能更为显著[12-13]。

综上所述，PCOS大鼠存在异常的氧化应激状态，给予槲皮素干预能较好地改善PCOS大鼠的氧化应激水平，但对卵巢的形态和性激素水平的影响不明显，适当延长槲皮素的给药时间可能具有更好的效果。