膜醭毕赤酵母对侵染苹果的扩展青霉拮抗作用研究

苟心怡，高子晗，田 真，张 婷，岳田利

(西北大学 食品科学与工程学院，陕西省食品安全风险识别控制技术研究中心，陕西省营养健康食品个性制造工程实验室，陕西省食品安全与营养健康创新转化平台，西安 710069)

苹果在采后储运和出售过程中，常面临机械损伤和真菌侵染的问题，从而引发变质腐败和经济损失[1]。扩展青霉(Penicilliumexpansum)是存在于多种水果中的产毒霉菌，是苹果腐烂过程中最重要的病原菌之一。其次生代谢物展青霉素是一种危害人类身体健康的真菌毒素[2]。目前，苹果青霉病防治方法常采用化学方法和物理方法。化学方法主要利用化学杀菌剂控制采后病害，但由于过量的残余农药，不益于人体健康与生态环境。物理方法如脉冲法、臭氧法，由于价格昂贵不能普遍应用[3]。而生物防治在果实采后病害方面不断取得突破，开始逐步替代化学杀菌剂和物理杀菌方法。在已有研究中，酵母的生物防治剂效果较好[4]。Cao等[5]研究发现Pichiacaribbica通过争夺空间和养分来有效防治扩展青霉引起的苹果采后青霉病；Zhang等[6]发现Pichiamembranefaciens对油桃的根霉病有显著的生物防治功效，通过诱导相关的防御酶活性提高油桃的抗病性；Sun等[7]研究表明Rhodosporidiumpaludigenum的细胞壁通过增强相关防御酶活性以及PR蛋白(PR1-like、endoGLU9、endoCHI-like和PR4)的基因表达有效防治梨果实青霉病。酵母因其对环境安全，且存在良好的抗逆性，在病原菌防治方面成效显著。

苹果的采后病害主要由致病真菌引发，扩展青霉侵染不仅导致果实的腐败还改变水果中挥发性有机化合物(VOC)的释放。在感染的苹果果实中，挥发性化合物的类型和含量会发生变化[8]。相关报道主要通过GC-MS对接种病原菌的苹果进行检测[9-10]。顶空气相色谱-离子迁移谱(HS-GC-IMS)技术结合气相色谱的简单便捷与离子迁移谱的高分辨率、高灵敏度等特点，样品不用前处理，检测时间短，现已应用到橄榄油等级、火腿掺假，蜂蜜产地等方面的食品检测[11]，相对于GC-MS更具应用优势。有关酵母控制苹果采后青霉病基于HS-GC-IMS识别检测方面的相关研究却鲜见报道。

本试验探究不同浓度的膜醭毕赤酵母细胞悬浮液对扩展青霉在体外和苹果上的抑制效果，并通过HS-GC-IMS检测膜醭毕赤酵母抑制扩展青霉引起的苹果青霉病的挥发性物质，为苹果采后青霉病的生物防治提供理论依据，也为GC-IMS应用于早期非视觉检测苹果中病原菌感染以及预后方面提供应对思路。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株 膜醭毕赤酵母(Pichiamembranifaciens)和扩展青霉(PenicilliumexpansumLPH10)保存于西北大学食品科学与工程学院，膜醭毕赤酵母悬浮液和LPH10孢子悬液制备按照蔡孟轩等[12]方法。

1.1.2 试验载体 供试‘红富士’苹果采自陕西洛川，取大小均一，无磕碰，颜色外观大致相同的苹果作为试验材料。随机挑选苹果，于体积分数为1% NaClO溶液浸润1 min后，用无菌水洗涤后在室温下风干。

1.1.3 培养基P.expansumLPH10：PDA培养基，膜醭毕赤酵母：YPD肉汤的配制参考文献[13-14]。

1.2 试验设计

1.2.1 膜醭毕赤酵母对扩展青霉的牛津杯抑菌试验 牛津杯抑菌试验采用刘冬梅等[15]方法，稍作改进。将10 mL PDA与100 μL扩展青霉LPH10孢子悬浮液(105CFU/mL)混合加入9 mm一次性培养皿作为第一层，随后将无菌牛津杯置于该层，待再次倒入的PDA凝固后移出，将108、107、106CFU/mL的250 μL膜醭毕赤酵母悬浮液加入琼脂孔中，置于28 ℃培养箱培养5 d后，测量并记录抑菌圈直径。

1.2.2 膜醭毕赤酵母对扩展青霉孢子萌发率和芽管长度的抑制 抑制孢子萌发率和芽管长度试验参照闫岩等[16]方法，稍作改进。将50 mL马铃薯葡萄糖PDB肉汤装入250 mL锥形瓶，分别加入1 mL不同浓度(108、107、106CFU/mL)的膜醭毕赤酵母细胞悬浮液，以无菌蒸馏水作为对照，同时将1 mL 浓度为107CFU/mL 的LPH10孢子悬液分别加入膜醭毕赤酵母和无菌水处理的锥形瓶中，置于28 ℃，75 r/min摇床培养12 h。显微镜观察与计数参照赵新贝等[17]方法。

1.2.3 膜醭毕赤酵母对扩展青霉生物量的影响 参照王艳玲等[18]方法，略作改动。分别将浓度为108、107、106CFU/mL的膜醭毕赤酵母细胞悬浮液加入到PDB肉汤培养基中，无菌水作为对照组(CK)。按照“1.2.2”方法处理，培养8 d，分别取第2、4、6、8天各组培养基中的菌丝体进行抽滤，无菌蒸馏水清洗，60 ℃烘干4 h后称量每组菌丝体干质量。

1.2.4 膜醭毕赤酵母对侵染苹果的扩展青霉的拮抗抑制作用 将“1.1.2”中供试苹果进行处理，在每个苹果果实的赤道处用无菌针形成均匀的伤口(直径3 mm，深度约2 mm)[19]，并用微量注射器将30 μL不同浓度的膜醭毕赤酵母细胞悬浮液(108、107、106CFU/mL)分别接种至伤口部位，30 μL无菌蒸馏水作为对照组(CK)。2 h后，将浓度为5×104CFU/mL的LPH10孢子悬浮液30 μL在同一伤口部位接入，用保鲜膜将处理后的苹果包裹后置于25 °C下培养，并维持较高的相对湿度(90%)，于第2、4、6、8、10天统计苹果的发病率和病变直径，每组供试10个苹果。

发病率=果实病孔数/接种总孔数×100%

1.2.5 基于HS-GC-IMS的膜醭毕赤酵母抑制苹果扩展青霉侵染识别检测 按照“1.2.4”方法进行苹果接种，将苹果分为2组，108CFU/mL的膜醭毕赤酵母拮抗组(P.M+LPH10)和对照组(LPH10)，对培养至第10 天苹果的接种部位进行取样，取0.6 g苹果组织于顶空瓶中，采用FlavourSpecR气相离子迁移谱联用仪进行检测，具体测试条件方法参照文献[20]并稍作调整。

1.3 数据处理

数据运用SPSS Statistics 19进行分析，origin 2018绘图；GC-IMS部分通过仪器配套的GC-IMS Library Search软件进行分析，并采用LAV中Gallery插件构建指纹图谱。

2 结果与分析

2.1 膜醭毕赤酵母对扩展青霉的牛津杯抑菌试验结果

由表1可知，106、107、108CFU/mL的酵母细胞悬浮液均对扩展青霉有抑制作用，且随着浓度增大，拮抗效果越显著。较低浓度的酵母106CFU/mL产生的抑菌圈仅有11.5 mm，而108CFU/mL的酵母悬浮液的抑菌圈直径为25.4 mm，抑菌效果最明显。

表1 膜醭毕赤酵母对扩展青霉在PDA上的抑制

2.2 膜醭毕赤酵母对扩展青霉孢子萌发率和芽管长度的抑制

图1表明，28 ℃培养12 h后，不同浓度的酵母处理组的孢子萌发率和芽管长度均显著低于CK组(P<0.05)，与对照组相比，108、107、106CFU/mL酵母处理组萌发率分别减少64.0%、55.9%、49.5%，芽管长度分别减少31.05、27.14、24.24 μm。由此可知，108CFU/mL酵母细胞悬浮液对扩展青霉孢子萌发率和芽管长度的抑制最佳。酵母在PDB中抑制LPH10孢子萌发和芽管长度的结果与牛津杯试验结果趋势相似，即高浓度的膜醭毕赤酵母悬浮液所产生的抑菌效果最明显。

2.3 膜醭毕赤酵母对扩展青霉生物量的影响

不同浓度的酵母细胞悬浮液对扩展青霉在PDB中的生长情况如图2所示。28 ℃下培养至第8 天，与对照组相比，108、107、106CFU/mL酵母处理组的菌丝体干质量均显著低于对照组(P<0.05)，且分别减少0.398 g、0.339 g、0.312 g。通过对第2、4、6、8天的菌丝体干质量进行测量，可知酵母能显著减少扩展青霉的生物量积累，酵母的浓度越大，抑制扩展青霉生长的效果越明显，高浓度108CFU/mL的抑制作用最显著(P< 0.05)。膜醭毕赤酵母通过抑制孢子的萌发来减少扩展青霉菌丝体的生长，进而降低LPH10生物量的积累，最终达到抑制其生长的目的。

2.4 膜醭毕赤酵母对侵染苹果的扩展青霉的拮抗抑制作用

不同浓度的酵母对扩展青霉侵染引发的青霉病发病率情况如图3所示，病变直径如图4所示。培养4 d，各处理组上升缓慢，且108CFU/mL、107CFU/mL处理组苹果伤口部位均未发病。4 d至10 d，对照组上升急剧，而108CFU/mL酵母处理组维持平缓。培养10 d，对照组发病率和病变直径分别为92.2%、18.5 mm，108CFU/mL酵母处理组的发病率为10.6%，病变直径为8.73 mm，较对照组分别减少81.6%、9.77 mm，明显抑制了苹果青霉病的产生。各酵母处理组苹果的发病率、病变直径均显著低于对照组(P<0.05)，其中108CFU/mL处理对减小病变直径及抑制扩展青霉感染的效果更佳。高浓度的膜醭毕赤酵母接种在苹果上可以快速生长且覆盖于伤口部位，争夺营养空间，使LPH10无法正常利用营养资源，从而抑制LPH10的生长与生物量的积累，最终表现出对苹果青霉病良好的防治功效。

2.5 基于HS-GC-IMS的膜醭毕赤酵母抑制苹果扩展青霉侵染识别检测

2.5.1 膜醭毕赤酵母抑制侵染苹果的扩展青霉挥发性化合物分析 采用GC-IMS对培养10 d的苹果(图5)进行上样分析。酵母抑制侵染苹果的扩展青霉的气相离子迁移色谱如图6所示，红色基准线右侧的每一个点与一种特征性挥发物一一对应，白色表示浓度较低，而红色则是浓度较高的表现。酵母拮抗组(P.M+LPH10)相比对照组(LPH10)，除了RIP峰两侧的点变多，即挥发性化合物增加，也可以明显看出信号峰颜色深浅的变化。通过构建扩展青霉感染苹果与膜醭毕赤酵母作为生物防治剂控制苹果采后青霉病的指纹图谱，比较各挥发性化合物组分之间含量差异(图7)，总共定性出挥发性有机物38种(表2)，主要由11种特征性酯类及23种醇醛化合物构成，酯类化合物是苹果中的主要挥发性成分，同时还包括3种酸类化合物和苯乙烯。本试验中，对照组中2,3-戊二酮、3-甲基-3-丁烯-1-醇、2-甲基丁醇、1-丁醇、苯甲醛含量比酵母拮抗组升高。已有研究表明，扩展青霉感染红富士苹果会导致丁醇、苯甲醛、3-甲基丁醛、苯乙烯水平升高[21]，本研究结果与此相似。此外，对照组LPH10中苯乙烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、丙酸乙酯、3-甲基丁酸含量明显高于酵母拮抗组，这几种化合物可作为苹果青霉病的挥发性标志物。且酵母处理组并未检测出苯乙烯，可知被扩展青霉侵染过的苹果经膜醭毕赤酵母拮抗后并未发生腐败。

表2 苹果中膜醭毕赤酵母抑制扩展青霉侵染产生的挥发性化合物

3 讨论与结论

在真菌病原体、果实和生物拮抗剂之间的相互作用过程中，拮抗酵母可通过多种作用方式发挥防治功效，包括争夺营养空间，形成生物膜，产生杀伤毒素和挥发性有机化合物，诱导果实抗性等[22]。竞争是一种有效的生物防治机制，当拮抗酵母在争夺空间的过程中，通常具有快速生长和形成胞外多糖囊的优势，这种多糖囊可以促进其粘附在水果表面，形成覆盖整个伤口区域的生物膜，从而抑制病原菌的生长[23-25]。刘程惠等[26]研究表明，Candidarailenensis对3种腐败霉菌皆表现出拮抗作用，且109CFU/mL的C.railenensis的拮抗作用最佳。而本研究膜醭毕赤酵母浓度为108CFU/mL时即可达到较显著的防治效果。闫岩等[16]研究发现Debaryomyceshansenii能抑制柑橘青霉病的发生，在108CFU/mL浓度时抑菌圈的直径为20.6 mm，而本研究中108CFU/mL膜醭毕赤酵母产生的抑菌圈直径为 25.4 mm，高于D.hanseni的抑菌直径。He等[27]研究中经茉莉酸酯增强的Meyerozymaguilliermondii组相比较对照组，孢子萌发率减少了 53.5%，而本研究中108CFU/mL处理组减少 64.0%，抑制效果更明显。苹果接种试验，培养10 d，108CFU/mL酵母拮抗组的发病率较对照组减少81.6%，随着接种酵母浓度的增大，发病率降低。分析由于高浓度的膜醭毕赤酵母快速生长并覆盖苹果的伤口部位，争夺营养与空间(如碳水化合物、氮、氧)[28]，从而抑制扩展青霉的生长繁殖。

苹果腐败时挥发性化合物会发生变化。研究报道，苯乙烯是扩展青霉感染苹果时产生的主要挥发物之一，来源于发酵、成熟、贮藏或分解过程中的微生物代谢，由于其强烈的刺激性气味会产生不良影响[29-31]。GC-IMS检测挥发性化合物时无需对样品进行前处理，检测线低至ppb级[32]，可以对样品进行快速检测。本试验中应用顶空气相色谱-离子迁移谱联用技术分别对只接种了扩展青霉和先接入膜醭毕赤酵母再接种扩展青霉的苹果进行分析，发现苯乙烯只在对照组中检测出，酵母拮抗组并未检测出，可以作为苹果腐败的预后标志物。结果表明，108CFU/mL膜醭毕赤酵母细胞悬浮液能有效抑制扩展青霉孢子萌发率和芽管长度，并抑制其生物量积累；接种在苹果上，高浓度组的酵母抑制扩展青霉的生长，并显著降低了发病率和病变直径。膜醭毕赤酵母作为生物防治剂可以有效防治苹果采后青霉病，同时通过GC-IMS技术可以实现早期快速检测苹果中发生的病原菌侵染，及时采取措施，从而减少水果采后腐败带来的损失。