蚕豆赤斑病病原菌分离鉴定及生物学特性研究

马生彪，王 立，蒋晶晶，冶晓燕，吕昭龙，李继平,，郑 果，惠娜娜

(1.甘肃农业大学 植物保护学院，兰州 730070；2.甘肃省农业科学院 植物保护研究所，兰州 730070；3.西北师范大学 生命科学学院，兰州 730070)

蚕豆(Broad bean)，又称胡豆、佛豆、川豆、罗汉豆等，为豆科蚕豆属1 a生草本植物[1]，分布在欧洲、非洲和亚洲的不同气候区。中国是世界上蚕豆种植面积最大的国家，同时也是蚕豆消费大国之一，仅2019年中国蚕豆市场需求量达 190.26万t[2]，蚕豆主要在甘肃、青海、湖北、云南、四川等地种植[3]。蚕豆除具有食用、药用和培肥地力等用途外[4]，更重要的是还可以作为青贮饲料，蚕豆营养价值较高,含有蛋白质、糖类、矿物质、维生素、钙和铁等[5-6]，是一种优质青饲料，蚕豆种植业的稳定发展既扩大青饲料的来源范围,又能有效地解决青饲料的利用时间差。

随着全球气候变化和人类活动等各种因素的影响，蚕豆种植产区各种病虫害问题日益凸显,造成产量损失非常严重[7]。特别是蚕豆赤斑病、霜霉病和枯萎病等[8]，严重影响蚕豆的正常生长发育、开花结荚,导致产量和品质大幅度下降。国内蚕豆赤斑病在长江流域和东南沿海的蚕豆产区，常年发病且严重[9]，自2008年，蚕豆赤斑病已经逐渐上升为甘肃省蚕豆种植产区主要病害[10]。据报道，蚕豆赤斑病可由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、蚕豆葡萄孢(B.fabae)、拟蚕豆葡萄孢(B.fabiopsis)引起[11-12]，主要危害蚕豆叶片、茎以及种子等部位，病原菌主要以菌核的形态在作物残茬上越冬，遇到高湿和适宜温度，对幼苗进行侵染，通过气流传播引起危害，导致蚕豆产量减少、品质下降，产量损失达28%～40%[13-14]。蚕豆的生长发育期除了病害防治外，水分、光照、种植方式和氮磷钾肥的科学配施等对蚕豆产量影响也至关重要[15-17]。

近年来，甘肃省蚕豆赤斑病发生有逐年加重趋势，严重影响蚕豆的产量和品质，据2020年在渭源、临夏等地调查，病田率达100%，平均损失率在30%以上，在防治方面技术落后，甘肃乃至西北有关蚕豆赤斑病的研究较少，尤其是在其病原及其生物学特性研究方面，甘肃仅在康乐县报道了蚕豆赤斑病病原菌，分离出灰葡萄孢(B.cinerea)、蚕豆葡萄孢(B.fabae)、拟蚕豆葡萄孢(B.fabiopsis)3 种病原，其中灰葡萄孢分离率最高[18]。本研究针对甘肃渭源县蚕豆赤斑病的致病菌种类与生物学特性开展研究，以期为该病害的有效防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试样品 病叶样本采自甘肃省渭源县蚕豆种植区发病植株。供试蚕豆品种为‘青蚕9号’。

1.1.2 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂13 g，加水定容至1 000 mL)、水琼脂培养基(water agar medium，WA)、燕麦片琼胶培养基、Czapek培养基[19]。以Czapek培养基为基础培养基，将培养基中的蔗糖分别替换成等质量的麦芽糖、乳糖和葡萄糖，制成不同碳源的培养基。采取同样的方法将培养基中的硝酸钠替换成等质量的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸铵、氯化铵和甘氨酸，制成不同氮源的培养基[20]。

1.1.3 试剂及仪器 琼脂粉(北京索莱宝科技有限公司)，葡萄糖(天津市大茂化学试剂厂)，蔗糖(天津市光复科技发展有限公司)，硝酸钠(广东光华科技股份有限公司)，真菌基因组DNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，Cat#D 2300 Size:100T)，生化培养箱(上海一恒科技有限公司，DHP-9162型)等。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌分离与纯化 将病叶用自来水冲洗，在病健交界处切取大小为4 mm×4 mm的叶块，浸入体积分数75%左右的酒精溶液中消毒 45 s，然后移入体积分数3%左右的次氯酸钠溶液中处理35 s(时间根据材料不同而定)，再用灭菌水清洗2次，转移至灭菌滤纸上，待水吸干后，用灭菌镊子移入PDA培养基平板上，每皿均匀移置5块，放入25 ℃恒温黑暗条件下培养5 d后，挑取菌落边缘的菌丝转接到PDA平板进行纯化，编号为WYCDCB，纯化菌在PDA斜面上置于4 ℃保存[19]。部分PDA平板上的纯化菌置于25 ℃恒温条件下观察菌落形态。

1.2.2 致病性测定 采用活体叶片孢子悬浮液接种法进行致病性测定。刮取PDA平板上待测菌株WYCDCB的菌丝至蒸馏水中，振荡涡旋，滤去菌丝残体，获得清液，用血球计数板进行计数，调整为1×105mL-1孢子悬浮液[21]，用移液枪吸取10 μL，滴2～4滴于蚕豆叶片表面，设重复3次[22]。采用同样的方法用移液枪滴2～4滴灭菌水为对照。

1.2.3 病原菌的鉴定 形态学鉴定：该菌在PDA平板活化后，用灭过菌的打孔器(直径为5 mm)打取菌饼，移置于PDA培养基平板中央，重复3次。置25 ℃恒温黑暗条件下培养，每隔1 d观察并记录菌落形态、气生菌丝状况、颜色变化等。对孢子形态、大小及颜色进行显微观察、拍照，根据形态学特征进行鉴定[23]。

分子生物学鉴定：利用真菌DNA提取试剂盒提取该菌株DNA，将菌株WYCDCB移植于PDA平板上进行活化，3 d后将菌落边缘的新鲜菌丝转到铺有灭菌玻璃纸的PDA平板上培养，7 d后刮取菌丝，提取DNA。PCR所用的引物为rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4[24]和蚕豆葡萄孢特异性引物G3PDH[23]。引物序列分别为ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)；G3PDHfor(5′-ATTGACATCGTCGCTGTCAACGA-3′)、G3PDHrev(5′-ACCCCACTCGTTGTCGTACCA-3′)。引物均由生工生物工程(上海)有限股份公司合成。DNA扩增产物送生工生物工程(上海)有限股份公司进行测序，获得的序列与GenBank数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)中获得相关葡萄孢的ITS和G3PDH基因序列进行比对。利用MEGA 7.0(www.megasoftware.net)软件以邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，确定待测菌株WYCDCB的种类。

1.2.4 生物学特性测定 温度对菌丝生长的影响：将待测菌株WYCDCB转接在PDA培养基中培养3 d后，打取直径为5 mm的菌饼，移至PDA平板上，分别于5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃黑暗培养，每个处理重复3次。黑暗培养7 d后，采用十字交叉法测量菌落直径[25]。

pH对菌丝生长的影响：采用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液，将PDA培养基pH调节为5、6、7、8、9、10、11，制成PDA平板，将待测菌株WYCDCB培养菌打成直径为5 mm的菌饼，移至以上PDA平板，置于25 ℃恒温黑暗培养箱中培养7 d，每处理重复3次[26]。采用十字交叉法测量菌落直径。

光照对菌丝生长的影响：将待测菌株WYCDCB的培养菌制成直径为5 mm的菌饼移至PDA平板上,在人工气候箱内设置4种光照条件，分别为24 h连续光照、16 h光照+8 h黑暗、12 h光照+12 h黑暗和24 h连续黑暗。置于 25 ℃恒温培养7 d，每处理重复3次。采用十字交叉法测量菌落直径。

碳、氮源对菌丝生长的影响：将待测菌株WYCDCB培养菌制成直径为5 mm的菌饼分别移至碳源为麦芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和缺碳源的Czapek培养基(对照)平板上，采取同样的方法将菌饼分别移至氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、甘氨酸和缺氮源的Czapek培养基(对照)平板上，置于25 ℃恒温黑暗培养7 d，每处理重复3次[27]。采用十字交叉法测量菌落直径。

培养基对菌丝生长的影响：将待测菌株WYCDCB 培养菌制成直径为5 mm的菌饼分别移至Czapek、PDA、WA和燕麦培养基平板上，25 ℃恒温黑暗培养7 d，每处理重复3次。采用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.5 数据统计与分析 DNA序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gon)序列比对工具BLAST程序(nucleotide blast)中进行序列比对分析，采用Mega 7.0软件构建系统发育树，Excel 2010、SPSS 23(IBM公司，美国)软件利用单因素方差分析法进行显著性分析(P<0.05表示差异显著)和制图。

2 结果与分析

2.1 蚕豆赤斑病症状与分离结果

蚕豆赤斑病症状：蚕豆赤斑病主要危害叶片，发病初期叶片布满黑褐色小斑点，后期逐渐扩展成卵圆形、椭圆形、长圆形等病斑，病斑中央略凹陷，周缘稍隆起，病健交界明显，病斑分布于叶片两面，严重时病斑处叶片表皮破裂形成裂痕(图1)。

2.2 致病性测定结果

对蚕豆叶片接种待测菌株WYCDCB，5 d后叶片产生大小不同的黑褐色病斑，15 d后病斑扩展成椭圆形和卵圆形，病斑颜色由黑褐色逐渐向浅褐色过度。25 d后叶片布满不规则病斑，病斑中央略凹陷，周缘稍隆起，叶片边缘开始枯萎。发病症状与田间采集的病叶症状类似。对接种发病叶片进行病原菌再分离、纯化培养，得到与原接种菌形态学相同的病原菌。因此，判定该病原菌为当地蚕豆赤斑病的致病菌(图2)。

2.3 病原菌菌落特征及显微形态

该菌株在PDA培养基上，菌落初期为灰白色，菌丝呈绳索状，长满培养皿后开始形成菌核，初期菌核颜色为浅褐色，后期产生大量排列不规则的黑褐色小菌核，菌核从菌丝块向边缘成熟，形状大多呈球形、椭圆形和卵圆形等。根据形态特征及显微形态可初步鉴定该病原菌为葡萄孢属(Botrytis)(图3)。

2.4 基因序列分析

经与GenBank数据库中葡萄孢属的一些种的rDNA-ITS和G3PDH序列比对，发现待测菌株WYCDCB的序列分别与蚕豆葡萄孢(MK217907.1)序列同源性达99%、蚕豆葡萄孢(AJ705013.1)序列同源性达100%，待测菌株WYCDCB与蚕豆葡萄孢的亲缘关系最近，且和对应的菌株在系统发育树上聚为一类。采用Mega 7.0邻接法(Neighbor-Joining)构建基于rDNA-ITS和G3PDH序列系统发育树，在Mega 7.0软件中Bootstrap method设置1 000次对系统树进行检验，待测菌株WYCDCB与蚕豆葡萄孢(MK217907.1；AJ705013.1)聚在系统发育树的同一个分枝(图4，图5)。能将待测菌株WYCDB与参照葡萄孢属的种分离开。因此，结合形态学及分子生物学将待测菌株鉴定为蚕豆葡萄孢(Botrytisfabae)。

2.5 生物学特性

2.5.1 温度对菌丝生长的影响 温度对菌株WYCDCB菌丝生长有明显的影响。测试表明在5～35 ℃温度菌丝均能生长(图6)，在PDA培养7 d后平均菌落直径为0.8～7.1 cm。但在不同温度条件下，该菌株菌落扩展速率不同，菌丝生长的适宜温度为15～25 ℃，平均菌落直径为 5.8～7.1 cm。最适温度为20 ℃，平均菌落直径为7.1 cm，该温度处理结果显著高于其他处理(P<0.05)，温度低于5 ℃或高于35 ℃时菌丝停止生长，由此可知该菌不耐高温和低温。

2.5.2 光照对菌丝生长的影响 菌株WYCDCB菌丝生长对光照不敏感(图7)。在不同光照24 h光照、16 h光照+8 h黑暗、12 h光照+12 h黑暗和24 h黑暗条件下，菌株在PDA上培养7 d，平均菌落直径分别为8.16、8.08、8.12和7.92 cm，4种光照条件下菌落直径无显著性差异(P>0.05)。

2.5.3 培养基对菌丝生长的影响 菌株WYCDCB在供试的4种不同培养基上均能生长(图8)。在PDA上生长最快，培养7 d后平均菌落直径为7.13 cm，显著高于其他3种培养基(P< 0.05)。

2.5.4 pH对菌丝生长的影响 不同pH对菌株WYCDCB菌丝生长有明显的影响(图9)。在供试的8种不同pH培养基上菌丝均能生长，pH为8时﹐菌丝生长速度最快，培养7 d后平均菌落直径为6.83 cm。由图9可见，pH为8的处理显著高于其他处理(P<0.05)。在pH为4和11的PDA培养基上菌丝生长缓慢，可见强酸和强碱的环境不利于病原菌生长。

2.5.5 碳源对菌丝生长的影响 菌株WYCDCB在5种不同碳源培养基中，生长具有一定的差异。菌丝生长最适碳源为乳糖，在乳糖培养基上培养7 d后平均菌落直径为5.43 cm。蔗糖和麦芽糖为碳源的培养基菌落直径显著低于对照(P<0.05)，说明蔗糖和麦芽糖为碳源影响病原菌的生长(图10)。

2.5.6 氮源对菌丝生长的影响 菌株WYCDCB对8种不同氮源的利用具有一定差异。在供试的8种氮源培养基上菌丝均能生长(图11)。在以酵母膏、牛肉膏、氯化铵和硫酸铵为氮源的培养基上，菌落直径显著高于对照(P<0.05)。说明酵母膏、牛肉膏、氯化铵和硫酸铵氮源培养基促进病原菌的生长。在甘氨酸为氮源的培养基抑制菌丝生长，培养7 d后平均菌落直径为2.17 cm，显著低于对照(P<0.05)，说明甘氨酸是病原菌的不良氮源。

3 讨论与结论

蚕豆赤斑病是蚕豆生产中一种毁灭性病害，不同蚕豆种植产区不同蚕豆品种，引起赤斑病的致病菌也不同。湖北地区蚕豆赤斑病致病菌为灰葡萄孢(B.cinerea)、蚕豆葡萄孢(B.fabae)和拟蚕豆葡萄孢(B.fabiopsis)，其中拟蚕豆葡萄孢引起蚕豆赤斑病在国内首次报道[23]。2012年报道除了湖北省外的部分省份也发现了拟蚕豆葡萄孢引起蚕豆赤斑病，安徽省和湖北省蚕豆赤斑病的致病菌为灰葡萄孢[18]。本研究仅在甘肃渭源县对‘临蚕9号’蚕豆品种进行蚕豆赤斑病病原菌研究，发现蚕豆赤斑病是由蚕豆葡萄孢引起的，暂未检测到灰葡萄孢、拟蚕豆葡萄孢，其原因可能与蚕豆种植产区及主栽的蚕豆品种有关，也可能是病原菌分离范围与数量有限所致。

对植物病原菌的生物学特性进行研究有助于了解病害发生规律及其与环境因素之间的联系。本研究结果表明，病原菌菌丝生长最适温度为20 ℃，低于5 ℃或高于35 ℃菌丝停止生长，最适pH为8。这与张静[23]对湖北地区蚕豆葡萄孢生物学特性研究结果有差异，其病原菌菌丝生长最适温度为25 ℃，30 ℃以上菌丝停止生长，最适pH为6，这可能与采样品种或地域不同有关；硫酸铵对菌丝生长具有抑制作用，这与本研究一致，本试验还研究甘氨酸对菌丝生长的影响，发现甘氨酸对菌丝的抑制作用更强；最适碳源为葡萄糖，蔗糖不适宜菌丝生长这一点与本试验结果一致。根据病原菌生物学特性研究结果，在蚕豆种植过程中可适量施加甘氨酸和硫酸铵以达到防控病害的目的。

甘肃省主栽蚕豆品种主要有‘临蚕6号’‘临蚕9号’‘临蚕13号’‘临蚕14号’‘陵西一寸’(日本)等，本研究仅对渭源县‘临蚕9号’蚕豆赤斑病病原菌进行研究，其他地区蚕豆赤斑病病原菌有待进一步研究。国外报道蚕豆赤斑病造成蚕豆感病品种产量损失高达61%，抗病品种产量损失达34%，选用抗病品种是防控病害主要途径[28]。中国重庆地区对赤斑病抗性较好的蚕豆品种有‘通蚕鲜8号’‘启豆2号’、高感品种有‘成胡10号’‘成胡14号’[29]。甘肃现有蚕豆品种对赤斑病抗病性究竟如何，能否加以利用，尚需进一步研究。