甘肃东部地区羊传染性脓疱皮炎病的调查及防治试验

常 亮

(甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉 744000)

羊传染性脓疱皮炎(contagious pustular dermatitis)俗称羊口疮，是由羊传染性脓疱皮炎病毒(Orf virus, ORFV)引起绵羊和山羊以口唇等处的皮肤和粘膜形成丘疹、脓疱、溃疡和结成疣状厚痂的接触性嗜上皮性传染病[1]。该病可感染人、犊牛、骆驼等。感染羊群后发病率高达90%，病死率为1%～25%[2]，经常造成养羊企业和养羊户的巨大经济损失。

此病临床上和羊痘、羊口蹄疫等羊的溃烂性皮炎病症状极为相似，所以，临床诊断容易导致误诊，要想进一步确定该病，需要进行血清抗体和病原的检测。目前，关于羊传染性脓疱皮炎病的血清学检测主要有病毒中和试验、酶联免疫吸附试验和蛋白质印迹技术等，病原学检测方法主要有电镜法、PCR法以及目前研究较热的环介导等温扩增技术等[3]。由于该病治疗无特效药，所以免疫预防就显得尤为重要，疫苗接种更是预防本病的重要手段。传统疫苗有灭活疫苗、弱毒疫苗等，这些都是将羊传染性脓疱皮炎病毒经过特殊处理后制作成具有产生抗体的疫苗，与传统疫苗相比，新型疫苗是近几年研究的热门，比如DNA疫苗、亚单位疫苗和基因工程苗等技术都在羊传染性脓疱皮炎疫苗研发中得到应用[4]。Zhao等[5]和李鹏飞等[6]构建的表达载体给小鼠接种后攻毒表明DNA疫苗可以作为羊口疮预防方法；在基因克隆及表达上，大多选择ORFV全基因组中的第11号基因，即B2L基因。因为该基因位于皮肤传染病区，基因全长1 137 bp，为一个完整的阅皮肤以及粘膜增生性病变基因。

红茂草又名秃疮花，主要在中国西北高寒地区生长，其生物碱抗病毒作用近年来也得到验证。秃疮花水溶性制剂主要应用于山羊痘(GP)、羊传染性脓疱皮炎(CPD)、鸡新城疫(ND)、鸡传染性支气管炎(IB)及羊的外科创伤、疥癣和瘘管外科疾病的防治上。关于红茂草在羊传染性脓疱皮炎的研究上，早在1998年，王廷璞等[7]就已经发现红茂草对ORFV有抑制作用。近年来，许多科研工作者在红茂草对羊传染性脓疱皮炎的治疗已做大量研究。马志宏等[8]利用红茂草不同剂型和浓度治疗羊传染性脓疱皮炎，显示出较好的效果。

近年来，羊传染性脓疱皮炎在国内的发生呈上升趋势。本病在甘肃省存在已久，从上世纪中叶起就有该病的报道[9]。近年来，随着养羊业的发展和饲喂模式的改进，本病在甘肃省呈不断扩展、蔓延之势。甘肃东部地区又是甘肃省养羊业比较集中的区域，该病有较高的发生率，为了摸清羊传染性脓疱皮炎在甘肃东部地区的发病情况，进行抽样调查，对发生该病羊群针对性地开展防治试验，以便为科学防治羊传染性脓疱皮炎病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

临床血样(采自甘肃省平凉市、庆阳市羊只，-20 ℃保存)。DNA提取试剂盒购自Qiagen 公司，PCR扩增试剂(TaqDNA聚合酶、PCR 反应缓冲液、dNTP)、DL2000 DNA Marker 和琼脂糖等均购自宝生物工程(大连)有限公司。红茂草兽用制剂(Ⅰ组为擦剂，Ⅱ组为粉剂、Ⅲ组为喷剂)、羊传染性脓包皮炎耐热性活疫苗由甘肃省畜牧兽医研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 羊传染性脓疱皮炎病毒的PCR检测方法建立 引物设计与合成：参照GenBank中公布的B2L基因序列，应用Primer 5.0软件设计一对检测引物，上游引物：5′-CACGGCCACGAACTTCCACCTCAA-3′，下游引物：5′-TCCCGCTCG-AAGACCGCAGACAG-3′，上述引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

B2L基因的扩增与扩增体系优化：按照 Qiagen 公司的DNA提取试剂盒操作说明进行临床血样的DNA提取。按照下列扩增体系进行B2L基因的PCR扩增:10×PCR Buffer 3 μL、TaqDNA聚合酶 0.5 μL、上下游引物各1.0 μL、DNA模板2.5 μL、ddH2O 17 μL。反应条件：94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，32个循环,72 ℃延伸10 min。利用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳进行结果检测。将扩增体系中各成分含量和退火温度设置梯度进行优化。

1.2.2 流行病学调查 羊痘在临床上主要表现为发热、无毛或少毛皮肤部出现丘疹和疱疹，而羊口疮则表现在以口唇、舌、鼻和乳房等部位形成丘疹、水疱或脓疱等，缺乏养殖经验的散户仅凭临床症状很容易将该病和羊痘相混淆。本次流行病学调查根据甘肃省平凉市和庆阳市羊产业养殖分布特点和养殖模式，采用整群抽样、问卷调查和随机抽样等为主的调查方法。随机抽样是根据在畜牧管理部门登记在册的养羊场随机抽样调查，并按比例随机抽样采集羊只血液，运用本试验建立的羊传染性脓疱病毒的PCR检测方法进行临床血样ORFV的PCR检测。

1.2.3 防治试验 治疗试验：对己患羊传染性脓疱皮炎的羊群，按群随机分组应用不同剂型的红茂草制剂进行治疗，以确定不同剂型的红茂草制剂的治愈率和治疗效果。治疗程序是对羊只的丘疹、水疤、脓疤、溃烂和疵状痴皮，先划破丘疹、水疤、脓痂，清除痴皮，用生理盐水冲洗伤口，用无菌药棉蘸干伤口残留的液体；再用不同剂型的红茂草制剂涂抹于水疤、脓疮、溃烂和疵状痴皮清除部，每天1～2次，连续治疗5 d，并观察疗效。

免疫预防：在羊传染性脓疱皮炎流行严重区域用羊传染性脓疱皮炎耐热性活疫苗对羊群免疫接种，统计接种羊群羊只数量及一个发病周期内免疫接种羊的免疫保护率。

2 结果与分析

2.1 羊传染性脓疱皮炎病毒的PCR检测方法 建立

B2L基因的PCR优化扩增体系如下：10×PCR Buffer 2.5 μL、TaqDNA聚合酶 0.5 μL、上下游引物各1.0 μL、DNA模板2 μL、ddH2O 18 μL。最佳退火温度为：56 ℃ 30 s。

琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR扩增产物大小为1 137 bp(图1)，与预期结果一致，该反应体系经过优化后建立的羊传染性脓疱皮炎病毒的PCR检测方法可用于实际检测应用中。

2.2 流行病学的调查

2018—2020年在甘肃东部地区的平凉和庆阳两市对230个羊场进行羊传染性脓疱皮炎问卷调查，统计2019年不同饲养模式下羊传染性脓疱皮炎的发病情况，统计结果见表1，并随机对羊只采集血样，用“羊接触传染性脓疱皮炎临床PCR诊断方法的建立及应用”课题组(以下称本课题组)建立的羊传染性脓疱皮炎PCR检测方法进行检测，结果见表2。

从表1可以看出，3种类型养羊模式下羊场羊传染性脓疱皮炎发病率分别为25.6%、59.7%和39.6%，说明本病在甘肃东部地区有较高的感染率，呈地方性流行。但不同的养殖模式羊传染性脓疱皮炎的发病率相差较大，养殖小区本病的发生率是规模养殖场的近两倍，个体养羊户也有较高的发生率，由此看来，规模养殖场管理规范，对防疫工作重视程度高，发病率相对较低，养殖小区羊数量虽然没有规模养殖场多，但羊群也比较集中，因此，防疫工作不到位容易导致该病的发生，而个体养羊户相对其他两种模式来说羊只数量明显减少，通过接触大面积传播的机率相对减少。从表2可知，经连续3 a采集血样，经本课题建立的羊传染性脓疱皮炎病毒PCR方法检测，结果显示甘肃东部地区每年羔羊患羊传染性脓疱皮炎核酸阳性率在16%以上。且阳性率在逐年降低，这可能与本地区近几年对该病防疫工作的重视程度有关。

表1 不同饲养管理模式下羊传染性脓疱皮炎发病情况

表2 羊传染性脓疱皮炎血液样品检测结果

2.3 不同剂型的红茂草制剂的治疗试验

在甘肃东部地区某羊场用不同剂型的红茂草制剂对不同年龄的患有羊传染性脓疱皮炎病的病羊的治疗效果(表3)。从表3可知，不同剂型的红茂草制剂对患有羊传染性脓疱皮炎病的羔羊和成年羊均有效，对成年羊的治疗效果略好于羔羊，但治愈率均能达到86.9%以上。

表3 红茂草制剂对羊传染性脓包皮炎治疗效果

2.4 免疫预防试验效果

在2019年用3个批次的耐热性羊传染性脓疱皮炎弱毒疫苗在甘肃东部地区示范应用16万只。从表4可知，3批次疫苗在接种后观察均无异常反应，接种21 d后统计结果显示，发病率为0.85%，比接种前下降24.15个百分点，说明羊传染性脓疱皮炎耐热性弱毒疫苗能有效地预防该病的发生和流行，由此反应，预防本病的发生必须做好免疫预防。

表4 羊传染性脓疱皮炎耐热性弱毒疫苗应用及效果统计

3 讨 论

羊传染性脓疱皮炎在所有养羊的国家和地区均有发生。近年来，传染性脓疱皮炎在中国甘肃、新疆、内蒙古、陕西、西藏、四川和云南等省区流行,给养羊业造成巨大损失。随着国家封山育林政策的实施，羊饲养模式由原来的放牧转变为舍饲饲养；市场需求的变化，跨区调羊更频繁，饲养规模向集约化规模化发展，这些因素，更容易造成也羊传染性脓疱皮炎病的发生和流行。原来羊传染性脓疱皮炎发生的面窄、数量小，现在发生的面宽、数量大，且在多数省份或地区呈流行态势，影响了养羊业的健康发展和收益[10]。

甘肃东部是西北地区畜牧业高度集中区，目前羊只年存栏达350多万只。本研究对甘肃东部地区230个不同规模羊场的调查发现，规模化羊场羊传染性脓疱皮炎发病率较低，仅为25.6%，而养殖小区内的羊场羊传染性脓疱皮炎发病率高达59.7%，但散养户的羊传染性脓疱皮炎的发病率高于规模化羊场14个百分点，低于养殖小区羊场的20.1个百分点。调查结果说明，规模化程度越高的羊场，防疫管理越重视，防疫措施越严格，羊传染性脓疱皮炎的感染率和发病率越低。

对发病羊用不同剂型的红茂草制剂治疗试验，证实3种不同剂型对羊只患有羊传染性脓疱皮炎均有很好的治疗效果，这与党岩等[11]的报道一致。这也进一步证实红茂草不论注射剂还是外用制剂均对患有羊传染性脓疱皮炎的羊只有效，治愈率均在86.9%以上。通过预防试验，证实了甘肃省畜牧兽医研究所研制的羊传染性脓疱皮炎耐热性活疫苗能够很好地预防羊传染性脓疱皮炎，保护率在99%以上。这一结果与秦崇凯等[12]报道一致。

要彻底地控制当前甘肃东部地区流行的羊传染性脓疱皮炎病，必须强化防治工作。要对本地区所有羊群进行连续3 a以上预防接种，同时要做好检测、检疫、隔离和治疗工作，逐步建立起无羊传染性脓疱皮炎病区域。只有这样才能消除和净化羊群中流行的羊传染性脓疱皮炎病，减少该地区养羊业的经济损失，促进羊产业快速发展。