8种微生物源药剂对葡萄苗圃根结线虫病的防治

李嘉泓，杜 娟，顾沛雯，张 乐，赵 楠，何金柱

(1.宁夏大学 农学院，银川 750021；2.杨凌翔林农业生物技术有限公司，陕西杨凌 712100；3.宁夏农垦玉泉营农场有限公司，银川 750104)

根结线虫(Meloidogynespp.)是世界上危害最严重的植物病原线虫，寄主范围广泛，为害严重[1]，一般减产10%～30%，严重时可达70%以上，严重制约蔬菜、粮食、果树及观赏作物的优质高产[2]。宁夏是中国生产优质酿酒葡萄的最佳生态区之一，近年来，随着葡萄种植面积的扩大和种植年限的延长，葡萄根结线虫病害在宁夏各产区呈蔓延趋势，尤其在葡萄育苗圃中发生严重，对葡萄苗木生产造成严重威胁[3]，已成为制约宁夏葡萄产业可持续发展的一大障碍。

根结线虫病为典型的土传病害，生产上多以化学药剂防治为主，但化学药剂会造成土壤污染和诱导线虫产生抗药性等问题，因此生物防治成为防治根结线虫病的最佳策略之一。芽胞杆菌(Bacillus)是细菌型生防药剂中最重要的一类，在防治根结线虫方面具有良好效果[4]。2011年，梁建根等[5]发现巨大芽胞杆菌(B.megaterium)发酵液对南方根结线虫(M.incognita)2龄幼虫有一定毒杀作用，校正死亡率为70.8%，在室内盆栽的防治效果为47.8%。2015年，席先梅等[6]发现蜡质芽胞杆菌(B.cereus)水剂对设施黄瓜、番茄根结线虫具有良好的防治效果，防效达 56.3%。2019年，D’Errico等[7]研究发现早春或早秋在番茄作物上施用坚强芽胞杆菌(B.firmus)，可抑制根结线虫的种群密度，促进番茄作物生长。淡紫拟青霉(Purpureocilliumlilacinum)作为一种线虫内寄生性真菌，是目前生产上广泛应用的杀线虫药剂。2014年，陆然等[8]研究发现淡紫拟青霉(P.lilacinum)对根结线虫卵孵化的相对抑制率达96.67%，并对根结线虫2龄幼虫具有较好的毒杀效果。2019年，Ahmed等[9]发现施用淡紫拟青霉(P.lilacinum)后，85%的根结线虫卵会被寄生，减少了根结线虫的侵染为害，促进番茄植株的生长。

本研究以宁夏玉泉营镇葡萄苗圃内根结线虫病为对象，在系统调查苗圃内根结线虫病危害的情况下，通过室内毒力测定和苗圃防效试验测定7种芽胞杆菌(Bacillus)和1种淡紫拟青霉(P.lilacinum)对葡萄根结线虫的毒杀效果，以期为葡萄苗圃根结线虫病害的生物防治提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试植物：2019年5-10月在宁夏玉泉营镇农垦集团感染根结线虫病的葡萄育苗基地生产区采集葡萄苗木，葡萄苗龄为1 a生，葡萄品种包括‘赤霞珠’‘霞多丽’‘西拉’‘品丽珠’‘黑比诺’‘梅鹿辄’‘马瑟兰’‘阳光玫瑰’‘夏黑’‘爱神玫瑰’‘大青’‘无核翠宝’‘红芭拉蒂’‘贝达’和‘抗砧3号’。

供试虫源：从葡萄品种阳光玫瑰幼苗根系中获得。先解剖根系的根结组织获得卵囊，将卵囊置于无菌水中，24 ℃恒温培养箱中孵化2～5 d，获取2龄幼虫，经鉴定为南方根结线虫(M.incognita)，用于室内防效试验。

供试药剂：100亿cfu/g侧孢芽胞杆菌可湿性粉剂、100亿cfu/g枯草芽胞杆菌可湿性粉剂、100亿cfu/g解淀粉芽胞杆菌可湿性粉剂、100亿cfu/g地衣芽胞杆菌可湿性粉剂、100亿cfu/g巨大芽胞杆菌可湿性粉剂、50亿cfu/g胶冻芽胞杆菌可湿性粉剂和50亿cfu/g蜡样芽胞杆菌可湿性粉剂，江苏绿科生物技术有限公司产品，推荐用量均为1～2 kg/667m2；100亿cfu/g淡紫拟青霉可湿性粉剂，山东诺杰生物科技有限公司，推荐用量为200～400 g/667m2；5%噻唑膦微乳剂，山东绿德地生物科技有限公司，推荐用量为1 250～1 500 mL/667m2；1.8%阿维菌素乳油，上海悦联化工有限公司，推荐用量为500 mL/667m2；25%复合氨基酸，江苏汉菱肥业有限责任公司。

1.2 方 法

1.2.1 葡萄苗圃根结线虫病症状及严重度调查 2019年5月，调查苗圃内15个葡萄品种根结线虫病害的发生情况，每个葡萄品种划分为3个样区，样区面积为10 m2(1 m×10 m)，样区内苗木数为70～80株，在每个样区中均按照随机取样的原则采集5株苗木，共采集225株葡萄苗木。依据拔根百分法[10]统计严重度，计算病情指数。严重度分级标准：0 级，根系无根结；1 级，根系1%～10%有根结；2 级，根系 11%～25%有根结；3级，根系 26%～50%有根结；4 级，根系 51%～75%有根结；5 级，根系 76%以上有根结。

病情指数=∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100

1.2.2 葡萄根结线虫病室内毒力测定 按药剂说明书，配置活化芽胞杆菌和淡紫拟青霉孢子粉的营养液(含0.001%红糖和0.01%复合氨基酸)。分别称取100 g侧孢芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、淡紫拟青霉孢子粉及200 g胶冻芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌孢子粉，溶解在1 L营养液中，30 ℃孵育12 h，用于激活菌剂。吸取摇匀菌液，按照稀释平板法[11]检测有效活菌数。依据活菌数将8种菌剂分别配置成有效孢子浓度为1.0×109cfu/mL的母液。用营养液稀释成孢子浓度为 1.0×108、5.0×107、2.5×107、1.25×107和 6.25×106cfu/mL梯度溶液，阿维菌素和噻唑膦依推荐用量分别配置为16.7 mg/L和50 mg/L的溶液。

采用程永等[12]直接触杀法进行室内毒力测定。具体操作如下：在96孔板酶标板(无锡国盛生物工程有限公司)上，每孔加入150 μL药液和10只活跃的2龄幼虫。每种药剂按孢子浓度设5组处理，每处理重复9次，另设阿维菌素和噻唑膦为阳性对照，清水为阴性对照。孵育在24 ℃恒温培养箱中，每隔12 h在光学显微下观察2龄幼虫的存活情况，持续观察4 d，计算校正死亡率。并拍照各药剂处理后2龄幼虫致死症状。

校正死亡率=(处理死亡率-清水对照死亡率)/(1-清水对照死亡率)×100%

1.2.3 葡萄苗圃根结线虫病防效试验 2019年10月于宁夏玉泉营镇葡萄育苗基地生产区设施温棚内开展田间防效试验。葡萄品种为阳光玫瑰，选用室内毒力测定防效好的3种药剂。按照“1.2.2”的方法分别将枯草芽胞杆菌、胶冻芽胞杆菌和淡紫拟青霉用营养液孵育活化，配置成孢子浓度为1.0×108cfu/mL的药液，以500 mL/667m2的阿维菌素(有效浓度为16.7 mg/L)和1 500 mL/667m2的噻唑膦(有效浓度为50 mg/L)作为阳性对照，施加等量清水为阴性对照，共设6个处理，每处理防治面积为10 m2(1 m×10 m)，处理间设置隔离保护行(两行)，每处理重复3次。各药剂共施用3次，施药间隔期为7 d。采用灌根方式每次每小区施药量为1 L。依据“1.2.1”中拔根百分法统计各处理间的病情指数。

参照刘玉霞等[13]的方法，每处理小区5点取样，每点取20 cm深的根际土壤，土样混合均匀后称取100 g，采用贝尔曼式漏斗法分离土壤中的根结线虫2龄幼虫，在血球计数板上计数线虫个数，统计在施药前和施药后各处理100 g土壤中线虫的数量，计算土壤线虫减退率，按土壤中线虫减退率计算防治效果。

线虫减退率=(处理前空白对照2龄幼虫数量-处理后小区2龄幼虫数量)/处理前空白对照2龄幼虫数量×100%

防治效果=(处理区2龄幼虫的减退率-对照区2龄幼虫减退率)/(1-对照区2龄幼虫减退率)×100%

1.2.4 数据处理 采用DPS软件，以专业统计-生物测定-数量型数据机值分析计算各药剂毒力回归方程斜率、相关系数和致死中浓度，用邓肯氏新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄苗圃根结线虫病症状

葡萄苗圃内根结线虫为害症状表现为地上部生长势弱、植株矮小，叶片黄化、易脱落，叶缘卷曲(图1-A)。根系(地下部)的主根和侧根均形成大小不一的根结，有的根结连接成块，形成褐色的根结瘤，最终根结连同病根腐烂坏亡，有的根结在根段上密集散布，形成念珠状结构。根系受害严重时通常表现出结瘤、短粗、丛生、坏死等症状，致使根系吸收肥水能力减弱，影响葡萄苗的生长(图1-B)。在体视显微镜下将根结表皮轻轻拨开，剖面上出现的白色梨形球状物为根结线虫雌虫，虫体主要寄生在根系的韧皮部(图1-C)。

2.2 葡萄苗圃根结线虫发病情况调查

宁夏玉泉营镇葡萄苗圃15个品种中，除‘抗砧3号’外，其余14个葡萄品种均感染根结线虫病，且不同葡萄品种受根结线虫为害的严重度有明显差异，其中‘西拉’感染根结线虫病最严重，病情指数高达78.33；其次是‘红芭拉蒂’，病情指数为70.00；‘大青’感染根结线虫病较轻，病情指数为21.67(表1)。

表1 宁夏玉泉营镇葡萄苗圃根结线虫病调查

2.3 葡萄根结线虫室内毒力测定

2.3.1 8种微生物源药剂对南方根结线虫2龄幼虫的毒杀效果 8种微生物源药剂在有效浓度为1.0×108cfu/mL触杀处理96 h(4 d)，淡紫拟青霉对2龄幼虫的累积校正死亡率最高，达 99.17%，与阿维菌素和噻唑膦致死效果相当；其次是胶冻芽胞杆菌，累积校正死亡率为85.00%；1.0×108cfu/mL枯草芽胞杆菌累积校正死亡率为52.50%，致死效果较好；其余药剂的累积校正死亡率均在50%以下，致死效果较差(表2)。

表2 8种微生物源药剂对南方根结线虫2龄幼虫的致死率

毒力测定结果表明，在处理96 h(4 d)后，淡紫拟青霉、胶冻芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌对南方根结线虫2龄幼虫的LC50值分别为3.56×106、3.69×106和8.58×107cfu/mL，毒力效果为淡紫拟青霉>胶冻芽胞杆菌>枯草芽胞杆菌。总体来看，淡紫拟青霉对南方根结线虫2龄幼虫的毒杀效果最强，胶冻芽胞杆菌次之，枯草芽胞杆菌则相对较弱(表3)。

表3 淡紫拟青霉、胶冻芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌对南方根结线虫2龄幼虫毒力测定相关参数

2.3.2 药剂在不同孢子浓度和处理时间下对南方根结线虫2龄幼虫致死效果 淡紫拟青霉(图2-A)、胶冻芽胞杆菌(图2-B)和枯草芽胞杆菌(图2-C)对南方根结线虫2龄幼虫的校正死亡率均随着孢子浓度和处理时间的增加而增高，且这3种药剂对2龄幼虫的致死效果不同。当药剂处理60 h时，使校正死亡率达到50%，淡紫拟青霉、胶冻芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌所需要的孢子浓度依次为6.25×106cfu/mL、1.25×107cfu/mL和 1.0×108cfu/mL。此外，当3种药剂孢子浓度为 1.0×108cfu/mL时，使校正死亡率均达到50%，淡紫拟青霉、胶冻芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌所需要的处理时间依次为24 h、36 h和60 h。表明淡紫拟青霉在较短的处理时间和较低的孢子浓度下，仍然会对2龄幼虫具有较好的致死效果。由此可知，淡紫拟青霉对南方根结线虫2龄幼虫的致死效果最好，胶冻芽胞杆菌次之，枯草芽胞杆菌相对较差。

2.3.3 不同药剂处理后南方根结线虫2龄幼虫致死症状 南方根结线虫2龄幼虫经枯草芽胞杆菌、胶冻芽胞杆菌、淡紫拟青霉和阿维菌素4种药剂处理后，虫体呈现“J”型死状，体前端出现小泡状的组织崩解(图3-A～3-D)，其中枯草芽胞杆菌处理后，整个虫体透明，虫体内容物变浅未发生聚集(图3-A)；胶冻芽胞杆菌处理后，虫体前端出现密集的点状小泡，组织崩解程度高(图3-B)；淡紫拟青霉处理后，体前端崩解程度低，虫体中部出现部分内容物聚集(图3-C)；阿维菌素处理后，体前端崩解程度高，且虫体中后端内容物大量聚集(图3-D)。噻唑膦处理后，整个虫体破裂，皱缩(图3-E)。

2.4 葡萄苗圃根结线虫的防效试验

淡紫拟青霉、胶冻芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌对葡萄苗圃内根结线虫病均有一定的防治效果，其中淡紫拟青霉的防效最好，根际土壤线虫减退率最高，为85.43%，防治效果可达83.11%；其次是胶冻芽胞杆菌，根际土壤的线虫减退率和防效分别为79.53%和76.26%，淡紫拟青霉和胶冻芽胞杆菌的防效均高于化学药剂噻唑膦；枯草芽胞杆菌的防效较差，应用价值低(表4)。

表4 3种微生物源药剂对葡萄苗圃根结线虫的防治效果

3 讨 论

根结线虫作为一类分布广、危害性大且难以防治的植物寄生线虫，已成为制约葡萄产业发展的重要病害。本研究调查发现，在葡萄苗圃内根结线虫病害发生较重，生产上广泛应用的酿酒葡萄品种‘西拉’的病情指数高达78.33。葡萄苗木受根结线虫的为害后，地上部表现出生长衰弱、植株矮小、叶片黄化，根系形成念珠状根结，这与刘勇等[14]发现的葡萄根结线虫病害症状一致。葡萄苗圃中高复种指数造成根结线虫的虫卵累积，导致根结线虫病害迅速传播蔓延，在生产上应当引起高度重视。

微生物源药剂具有环境污染小、对人畜安全、不易产生抗药性等优点，已逐渐替代化学药剂，成为线虫病害绿色防控的主要手段[15]。本研究通过室内毒力测定和苗圃防效试验测定了8种生物药剂对葡萄根结线虫病的防效，发现淡紫拟青霉(P.lilacinum)对根结线虫2龄幼虫具有良好的毒杀和防治效果(校正死亡率为99.17%和防治效果为83.11%)，能破坏根结线虫2龄幼虫内部组织，使其死亡。这与王曦茁等[16]和Sarven等[17]的研究结果一致。

胶冻芽胞杆菌(B.mucilaginosus)是一种硅酸盐细菌，具有分解铝硅盐类原生质态矿物的能力，常被用作果蔬和农作物种植的微生物菌肥[18]。研究发现胶冻芽胞杆菌(B.mucilaginosus)具有病害防治的潜质，在棉花炭疽病、茄子和香蕉枯萎病等病害防治已有良好的应用前景[19-20]。但目前国内尚未有关于胶冻芽胞杆菌(B.mucilaginosus)防治线虫病害的研究报道，本研究首次发现胶冻芽胞杆菌(B.mucilaginosus)具有杀线活性(校正死亡率为85.00%和防治效果为76.26%)，这对今后微生物源杀线制剂的开发及应用提供理论依据。

微生物源药剂作为一种安全有效手段在植物根结线虫防治中得到了广泛的研究和应用[21]。本研究成功筛选出淡紫拟青霉(P.lilacinum)和胶冻芽胞杆菌(B.mucilaginosus)两种微生物源药剂能有效防治葡萄根结线虫病，可作为葡萄苗圃内根结线虫病害防治的首选药剂进行推广应用。