基于低共熔溶剂提取紫薯中花青素研究

徐唐芸，黄达敏，鲁东昊，陆 翔，陈凌涛，陈培云

（浙江万里学院 生物与环境学院，浙江 宁波 315000）

随着人工合成添加剂安全问题的日益凸显及人们对健康的关注，以植物为原料获取安全、无毒、高效的生物活性物质已成为当前亟待解决的重要问题[1]。低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents，DESs），主要是由氯化胆碱（Choline chloride，ChCl）等氢键受体与糖（葡萄糖、蔗糖、果糖等）、有机酸（乳酸、苹果酸、柠檬酸等）、多元醇（乙二醇、丙三醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇）等氢键供体组成的液体混合物。作为一种环境友好型溶剂，低共熔溶剂具有蒸汽压低、制备简单、价格低廉、可生物降解、无毒、对不同极性化合物提取能力强、提取效率高、可回收重复利用等优点[2-5]，可用于替代传统或有毒的有机试剂。目前，DESs已被成功应用于植物活性成分的萃取，包括萃取黄芩、丹参、金银花、木豆叶、降香叶、红花、槐花、青蒿、夏枯草、茴香等中药材，橄榄油、棕榈油等食用油，山竹果、蔓越橘、葡萄、李子等水果，西兰花、洋葱等蔬菜，沙棘叶等植物叶子中的黄酮类化合物、酚酸、花青素、萜类化合物、皂苷类和生物碱等，对天然活性成分表现出高效的提取效果[6-13]。

花青素因其抗氧化、抗癌、保护视网膜、降低血脂、抗衰老和改善肠道健康等作用而备受人们的关注[14]。提取花青素常规提取溶剂多选择甲醇、乙醇、丙酮、水或者混合溶剂等，大多具有毒性，普遍存在污染环境的问题。在应用DESs提取植物花青素方面，栾琳琳等人[15]建立了以含水量为40%的氯化胆碱/1,2-丙二醇低共熔溶剂，从桑葚果渣中提取花青素的方法。Sang J等人[16]利用含10%水（V/V）的氯化胆碱/1,2-丙二醇（1∶2，mol/mol）的低共溶熔剂从黑枸杞中提取和分离总花色苷。紫薯色素属于花青素类物质，含量丰富且稳定性高，紫薯产量高，价格低廉，提取成本低，以紫薯为原料可以有效地解决当前工业化生产花青素的不足。设计合成低共熔溶剂用于紫薯的提取研究，以紫薯中花青素的提取率为指标，采用单因素试验和正交试验优化紫薯中花青素的提取工艺，以期提供一种高效环保的提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫薯，购于宁波当地超市；氯化胆碱、葡萄糖、尿素、蔗糖、醋酸钠、冰醋酸，国药集团化学试剂有限公司提供，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

L18-Y91A型高速破壁调理机，九阳股份有限公司产品；HH-2型数显恒温水浴锅，金坛市盛蓝仪器制造有限公司产品；DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱，上海蚁霖科学仪器有限公司产品；QL861型漩涡振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品；LC-180型低速离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司产品；UV-3000PC型紫外可见分光光度计，上海翱艺仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 不同低共熔溶剂的制备

参照文献[17]方法制备低共熔溶剂。将氢键供体（HBD）氯化胆碱和不同的氢键受体（HBA）（葡萄糖、柠檬酸、蔗糖、尿素等）放入60℃真空干燥箱中干燥24 h，在圆底烧瓶中将一定的摩尔比HBD和HBA充分混合。在加热条件下，用磁力搅拌器搅拌，得到澄清、均匀、透明的混合物。冷却至室温后，在真空干燥箱中于80℃下干燥48 h后，将其取出并密封储存。

1.3.2 紫薯样品处理

选择新鲜的紫薯，清洗后90℃下烘干5 h至恒质量，研钵粉碎、过90目筛，得到紫薯粉，避光保存备用。

1.3.3 紫薯花青素的提取

准确称取1.000 g处理好紫薯样品，置于试管中。以低共熔溶剂为提取溶剂，加入10 mL于试管中进行水浴提取，提取结束后，离心后取上清液进行花青素的测定。

1.3.4 花青素提取率的测定

参照文献[18]方法。取上清液1 mL于10 mL比色管中，加入9 mL pH值4.5缓冲液，静置2 h，紫薯花色苷的最大吸收波长为530 nm。在波长530 nm处测定吸光度。以蒸馏水作对照溶剂调零。重复测定3次，记录数据。

计算值即得100 g原料中含总花色苷含量（mg）。式中：E——530 nm处用分光光度计直接测定的吸

光度（A530）；

V——萃取液测定时稀释的总体积，mL；

M——样品质量，g；

98.2 ——1%花色苷摩尔消光系数。

1.3.5 单因素试验

（1）不同低共熔溶剂对紫薯花青素得率的影响。固定含水量20%，摩尔比1∶2，料液比1∶10，浸提时间2 h，浸提温度60℃，选择了4种氢键供体（柠檬酸、葡萄糖、尿素、蔗糖）和氢键受体（氯化胆碱）按2∶1的摩尔比进行组合配制形成天然低共熔溶剂，考查4种不同氢键供体低共熔溶剂对紫薯花青素提取的影响。

（2）摩尔比对紫薯花青素得率的影响。固定氯化胆碱-柠檬酸为提取紫薯花青素的DES溶剂，在含水量为20%，料液比为1∶10，温度为60℃，提取时间为2 h，考查氯化胆碱与柠檬酸摩尔比分别为1∶1.0，1∶1.5，1∶2.0，1∶2.5，1∶3.0，1∶3.5，1∶4.0时制备的DESs对提取紫薯中花青素的影响。

（3）含水量对紫薯花青素得率的影响。固定氯化胆碱与柠檬酸摩尔比为1∶2，料液比为1∶10，温度为60℃，浸提时间为2 h，考查含水量为15%，20%，25%，30%，35%的DESs分别进行提取，确定提取效果最佳时的DESs含水量。

（4）不同提取时间对紫薯花青素得率的影响。固定氯化胆碱与柠檬酸摩尔比为1∶2，在料液比为1∶10，含水量为20%，温度为60℃，提取时间分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h，计算紫薯花青素得率，确定提取效果最佳的时间。

（5）不同提取温度对紫薯花青素得率的影响。固定氯化胆碱与柠檬酸摩尔比为1∶2，在料液比为1∶10，含水量为20%，提取时间为2 h，提取温度分别为20，30，40，50，60，70，80℃时，计算紫薯花青素得率。考查20~80℃温度变化范围内，不同温度变化因素对紫薯花青素提取的影响。

1.3.6 正交试验

在单因素试验的基础上优化试验结果，选取提取工艺条件摩尔比、含水量、温度和提取时间进行L9（34），探讨该4个因素及其不同水平对紫薯中花青素提取的影响。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 DES种类对紫薯花青素得率的影响

提取溶剂对提取效果起关键作用，不同氢键供体的类型是影响DESs密度、表面张力和黏度等物理化学性质的因素，也对目标成分的提取有重要影响[19]。以氯化胆碱为HBA，并选择不一样的HBD，加热搅拌后制备DES。比较不同的HBD的DES对花青素得率的影响，制备4种不同的DES，花青素得率的大小依次为柠檬酸>葡萄糖>蔗糖>尿素。因此，最终确定氯化胆碱-柠檬酸为最佳提取溶剂，作为后续的试验条件。

不同低共熔溶剂对紫薯花青素的提取率见图1。

图1 不同低共熔溶剂对紫薯花青素的提取率

2.1.2 低共熔溶剂体系的摩尔比对紫薯花青素得率的影响

摩尔比对紫薯花青素提取率的影响见图2。

图2 摩尔比对紫薯花青素提取率的影响

由图2可知，随HBA-HBD摩尔比的增大，得率也在提高，在HBA-HBD摩尔比为1∶2时达到最大值，在更高的摩尔比时，得率反而下降。可能是因为摩尔比为1∶2的DES具有更低的黏度和表面张力，提高了传质率，使提取溶剂更易去渗透和促进溶出紫薯中的花青素。因此，确定氯化胆碱（HBA）/1,4-丁二醇（HBD）摩尔比为1∶3的DES为最佳比例的提取溶剂，作为后续的试验条件。

2.1.3 提取含水量的影响

含水量对紫薯花青素提取的影响见图3。

由图3可知，随着DES含水量的增多，花青素的得率不断上升，当DES含水量为20%时，花青素提取率为0.937 mg/g，达到最高；含水量超过25%后，花青素得率开始下降。这可能是因为含水量影响DES的极性和黏度，水的加入使DES的黏度降低和极性增加，但是过量的水反而会抑制成分间的相互作用，因此确定DES最佳含水量为20%作为后续的试验条件。

图3 含水量对紫薯花青素提取的影响

2.1.4 提取时间的影响

提取时间对紫薯花青素提取率的影响见图4。

图4 提取时间对紫薯花青素提取率的影响

由图4可知，随着提取时间的延长，紫薯花青素的得率升高，当提取时间达到2.5 h后，紫薯花青素得率达到最大，且不再增加反而出现降低。这可能是因为随着提取时间的增加，使DES充分渗透于紫薯颗粒中，促使目标物质溶出，使花青素得率提高。而进一步延长萃取时间可能会导致目标化合物的分解或者是发生其他的化学反应。因此，确定2.5 h为最佳提取时间。

2.1.5 提取温度的影响

提取温度对紫薯花青素提取的影响见图5。

图5 提取温度对紫薯花青素提取的影响

由图5可知，随着提取温度在一定范围内的不断升高，紫薯花青素得率呈上升趋势。当提取温度到达60℃时，得率到达最高，随后得率随提取温度的升高反而降落。这可能是因为升高温度会导致DES的黏度、表面张力和极性降低，有利于花青素的溶出，升高温度会加快分子的活动，加快目标物质扩散。但过高的温度将会导致花青素发生如水解、氧化等反应，从而降低得率。因此，确定提取温度为60℃。

2.2 正交试验结果

正交试验结果分析见表5。

表5 正交试验结果分析

由表5可知，提取过程中含水量和提取温度这2个因素对紫甘薯中花青素的提取效果影响较大，低共熔溶剂的摩尔比和提取时间这2个因素的影响效果较小，因素影响顺序为B>C>D>A。即含水量>提取温度>提取时间>摩尔比，提取过程中含水量和提取温度对紫薯中花青素提取效果影响较大，低共熔溶剂的摩尔比和提取时间的影响较小。最佳提取组合为A2B3C3D3，即含水量25%，摩尔比1∶2.0的氯化胆碱-柠檬酸体系为提取剂，料液比为1∶10，提取温度80℃，提取时间3.0 h为紫薯花青素最佳提取条件，此时花青素的提取率达1.086±0.022 mg/g。

3 结论

紫薯中富含花青素，采用低共熔溶剂作为溶剂，以紫薯花青素得率为指标，采用单因素试验和正交试验优化紫薯花青素的提取工艺。选用摩尔比为1∶2.0的氯化胆碱-柠檬酸制备低共熔溶剂，取得当低共熔溶剂含水量为25%，料液比1∶10，提取温度80℃，提取时间3.0 h时，花青素得率可达1.086±0.022 mg/g的结果。该方法工艺条件温和，不需要高温高压，花青素的提取率较高，水解和生物分解损失率低。该研究结果表明低共熔溶剂可作为提取紫薯中花青素的有效提取溶剂。