云南省部分地区鸡住白细胞虫的分子鉴定与流行分析

董仙兰，翟国莲，徐 聪，杜娟娟，普丽花，王开胜

(1.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201；2.云南省永德县动物卫生监督所，云南 临沧 677600；3.玉溪市动物疫病预防控制中心，云南 玉溪 653100；4.玉林师范学院生物与制药学院，广西 玉林 537000)

近些年来，云南省鸡养殖业发展较快，在肉鸡和蛋鸡养殖基地方面，其规模仅次于四川省，是地方特色品种最多的省份之一[1]。随着各地养殖规模的扩大，鸡的经济价值就成为研究人员和养殖业者关注的热点问题之一。然而，寄生虫病成为制约鸡养殖业发展的一大障碍，其中，鸡住白细胞虫病的危害较为严重，其原因是鸡舍周围存在库蠓和蚋等传播媒介，从而导致住白细胞虫病的流行。

住白细胞虫是疟原虫科(Plasmodiidae)住白细胞虫属(Leucoytozoon)的原虫，主要寄生于禽类的血细胞和内脏器官组织细胞内，造成机体全身性出血，鸡冠和肉髯苍白[2]。在我国鸡群中流行的住白细胞虫包括卡氏住白细胞虫(Leucocytozooncaulleryi)和沙氏住白细胞虫(Leucocytozoonsabrazesi)两种，其中卡氏住白细胞虫的发病率较高，该虫的传播媒介为库蠓等吸血昆虫，具有明显的季节性流行特点。而在其他国家，还流行史氏住白细胞虫(Leucocytozoonsmithi)、休氏住白细胞虫(Leucocytozoonschoutedeni)和西氏住白细胞虫(Leucocytozoonsimondi)等[3-5]。

本试验基于血液原虫的线粒体细胞色素b基因(cytb)进行巢式PCR扩增，对来自云南省5个不同地理区域的部分养鸡场进行住白细胞虫的检测，以期明确云南地区鸡场中主要流行的住白细胞虫虫种类型，为有效防控云南养鸡场住白细胞虫病的流行提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源 2018年7—9月，用EDTA-2K抗凝管采集云南红河州、怒江、昭通、楚雄和临沧5个地区的鸡的血样共计970份，样品编号分别为红河(HH1～HH231)、怒江(NJ1～NJ107)、昭通(ZT1～ZT136)、临沧(LC1～LC287)和楚雄(CX1～CX209)，并记录采样的时间、地点、品种、性别、日龄等信息，低温保存。带回实验室后置于4 ℃冰箱保存，备检。

1.2 主要试剂和设备 1×TAE 缓冲液、血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司；DL2 000 DNA marker，购自宝生物工程(大连)有限公司；2×TaqPCR Master Mix，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 形态学观察 涂好的血涂片风干，利用吉姆萨染液快速染色后在显微镜下对住白细胞虫进行形态学观察。

1.4 DNA的提取与PCR扩增 按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书将采集的鸡血液样品进行DNA提取，然后将其放入-20 ℃冰箱进行保存，后续进行PCR分析。参考Iezhova等[6]报道的引物对血液原虫cytb基因进行巢式PCR扩增。第1轮扩增引物：HAEMNF 5′-CATATATTAAGAGA-ATTATGGAG-3′；HAEMNR2 5′-AGAGGTGTAGCAT-ATCTATCTAC-3′。第2轮扩增引物：HAEMF 5′-ATGGTGCTTTCGATATATGCATG-3′；HAEMR2 5′-GC-ATTATCTGGATGTGATAATGGT-3′。PCR反应扩增体系为25 μL：ddH2O 11.0 μL；2×TaqPCR Master Mix 11.0 μL；上下游引物各0.5 μL；模板DNA为2.0 μL。第1、2轮反应扩增体系一致。反应程序:第1轮94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共25个循环；72 ℃ 10 min,16 ℃结束，保存。第2轮 35个循环，其余程序均与第1轮相同。反应结束后，取5 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.5cytb基因部分序列测定及遗传进化分析 将PCR阳性产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果用SeqMan 5.01拼接，拼接序列提交至NCBI中BLAST在线比对，下载GenBank中公布的住白细胞虫相关序列，采用邻接法(Neighbor-joining method)在MEGA 6.0软件中构建系统进化树。

1.6 统计与分析 将所得试验数据用IBM SPSS Statistics 20软件进行卡方检验，用SAS 9.1计算比值比(OR)和95%置信区间(95%CI)，分析鸡住白细胞虫感染与不同地区、性别、日龄和品种之间的关联程度。

2 结果

2.1 形态学观察 住白细胞原虫的形态特征与其在宿主体内的发育过程密切相关，其游离裂殖子大小在0.5～1 μm，大多数情况下，在血细胞中呈单个散在，或3～7个聚集成团的状态。进入宿主细胞中的裂殖子的位置处于红、白细胞的胞质中，但进入宿主细胞的裂殖子不仅仅只有1个，在某些特定情况下，会出现多个入侵同一细胞的情况，见图1。

图1 鸡住白细胞虫形态

2.2 分子鉴定 检测结果表明，970份鸡血液样品中有34份感染住白细胞虫，感染率为3.51%。图2为部分鸡血液样品中住白细胞虫的cytb基因序列PCR扩增电泳结果。将各个地区扩增的巢式PCR产物送至测序公司进行测序，将拼接结果在NCBI的BLAST上比对分析，样本的序列比较见表1，本试验样品与泰国、印度、日本、韩国、马来西亚的卡氏住白细胞虫(L.caulleryi)同源性分别为99.80%、99.40%、99.79%和100.00%。

表1 部分样品cytb基因在NCBI中BLAST同源性比较

图2 部分样品住白细胞虫的cytb序列PCR产物电泳图

2.3 鸡住白细胞虫流行分析 对云南省5个不同地理区域采集的970份鸡血液样品进行检测，分别针对检出住白细胞虫的不同地理区域、性别、日龄和品种的鸡进行了OR值、P值的计算，统计结果见表2，地理区域的阳性率从高到低是怒江、昭通、临沧、红河，楚雄地区未发现住白细胞虫感染；性别中母鸡的住白细胞虫阳性率为高于公鸡；日龄中最高的是180日龄以上，其次是90～180日龄，90日龄以下未发现住白细胞虫的感染；品种中阳性率从高到低依次是毒龙原鸡、草鸡、白壳蛋鸡、三黄鸡，但罗曼蛋鸡、铁脚麻鸡和黄连鸡均未发现住白细胞虫感染。

表2 不同地理区域、性别、日龄和品种鸡住白细胞虫的感染情况

2.4 系统发育进化树的构建 将本试验中从红河(HH5)、怒江(NJ2、NJ42、NJ47、NJ57)、昭通(ZT41、ZT47、ZT66)、临沧(LC34、LC57、LC58)4个地理区域所获得的虫株cytb基因序列与GenBank中公布的其他住白细胞虫相关序列进行同源性比对分析后，用MEGA 6.0软件的N-J法构建系统进化树，结果显示：根据cytb基因进化树，可大概分为两大支，本试验中NJ47、ZT41、ZT47、LC57所检测到的卡氏住白细胞虫与韩国、日本、印度等国家的鸡中检测到的卡氏住白细胞虫以65%的置信度聚为同一大分支，并与HH5以100%的置信度聚为一支；LC34、LC58、NJ57、NJ2以100%的置信度与马来西亚的卡氏住白细胞虫单独聚为另一大分支，由此可见，本次在云南地区所检住白细胞虫虫株与卡氏住白细胞虫进化支关系最为接近(图3)。

图3 基于住白细胞虫cytb序列同源性构建的系统发育进化树

3 讨论

3.1 住白细胞虫流行情况 卡氏住白细胞虫病最初于1909年在越南北部发现，随后印度、马来西亚、泰国和越南等地相继报道该病的发生[7]；1958年，日本也报道该病，同年，我国台湾发现该病；1980年，张泽纪等首次在广州地区的病鸡中分离出该病原，证实我国大陆也存在卡氏住白细胞虫的流行[8-9]。随后，在北京、上海、广东、广西、陕西、山西、云南、河北、四川、福建等20多个省市报道了该病的存在与流行[10]。2003年，李国清等[11]运用PCR技术扩增了卡氏住白细胞虫rDNA的ITS-2及部分5.8S和28S序列(ITS2+),并对该序列进行了克隆和测序。Zhao等[12]运用PCR扩增血液原虫的cytb基因和细胞色素C氧化酶Ⅲ(coxⅢ)来检测家禽住白细胞虫感染情况。

本试验用PCR扩增住白细胞虫的cytb基因，结果显示，云南地区部分养鸡场存在住白细胞虫感染，感染率为3.51%，与刘毅等[13]报道的湖南地区住白细胞虫感染率(7.9%)，李国清等[14]报道的广东(10.3%)、山东(12.6%)、福建(24.5%)的感染率，钟友苏等[15]报道的贵州道真县沙氏住白细胞虫的感染率(55.14%)，国外Sehgal等[16]报道的乌干达和喀麦隆的休氏住白细胞虫感染率(18.3%)相比，本试验中鸡住白细胞虫的感染率较低，其原因可能与各个地区的气候条件、库蠓和蚋等中间宿主的流行情况和饲养管理存在差异有关，从而导致各地区该病的感染率有所不同。本次调查的云南省5个地区的住白细胞虫平均感染率较低，表明该虫在云南地区的总体流行情况较轻，经调查发现，这可能同大多数养殖场的选址较为规范、饲养管理水平较高有关。

3.2 感染情况分析 本试验中，云南省怒江地区的阳性率最高，为16.82%(18/107)，红河地区检出的阳性率最低，为0.87%(2/231)，造成各地理区域间差异的原因可能与海拔有关。由于怒江地区的海拔略高，气候温暖潮湿，更有利于传播媒介库蠓的生长和繁殖；母鸡的阳性率与公鸡的阳性率相近，为4.06%(22/542)，公鸡的阳性率为2.80%(36/428)，公鸡和母鸡均易感染住白细胞虫，不同性别间鸡住白细胞虫的感染率无显著性差异(P>0.05)，这与刘毅等[13]报道的湖南地区和钟友苏等[15]报道的贵州道真县不同性别间鸡的住白细胞虫感染差异不显著情况相一致；180日龄以上的鸡的阳性率最高，为7.19%(33/459)，90日龄以下的鸡的阳性率为0。结合样本信息，日龄较大的鸡的样品多来源于高海拔地区，而低于90日龄的鸡多来源于低海拔地区。分析其可能原因，除日龄过大的鸡其抵抗力更低之外，海拔因素仍然是鸡群易感该病的关键因素，处于高海拔地区的鸡群更易感染该病。1964年，陈天铎等[17]调查了福州地区家禽的住白细胞虫感染情况，结果显示，雏鸡的感染率为23.07%，成年鸡的感染率为52.94%；2002年，黄占欣[18]调查了河北省鸡的住白细胞虫感染情况，发现雏鸡的感染率为27.6%，育成鸡的感染率为65.2%，成年鸡的感染率为49.5%，而本试验的结果显示，雏鸡(<90日龄)的住白细胞虫感染率为0，育成鸡(90～180日龄)的感染率为2.84%，成年鸡(>180日龄)的感染率为15.71%，本试验结果同李渤南等[19]报道的鸡的年龄与住白细胞虫的感染率成正比、与发病率成反比的结果相一致；本试验所涉及的鸡的品种中，独龙原鸡的阳性率最高，为16.82%(18/107),其样品采集均来源于怒江地区。该地区的鸡多为笼养，其运动范围狭窄，导致鸡群间易发生交叉感染。2017年，熊维平[20]报道福建省大田县不同品种鸡住白细胞虫感染率，其中麻鸡为24.7%，三黄鸡为15.0%，罗曼褐壳蛋鸡为12.5%，土杂鸡为15.0%；刘毅等[13]报道了湖南地区不同品种鸡住白细胞虫感染率，其中，当地鸡感染率为77.1%，长沙黄鸡感染率为94.6%。上述报道中，不同品种间住白细胞虫的感染情况有所差异。本试验中，不同品种的鸡住白细胞虫感染率也存在极显著性差异(P<0.01)，其中的原因，一方面可能与各个地州的地理位置、气候条件和养殖管理等差异有关，另一方面可能与鸡本身的抵抗力有关；在对云南省部分地区的鸡感染住白细胞虫的风险因素分析中发现，地理环境、日龄、品种间的阳性率均存在极显著相关性(P<0.001)，而性别间无显著相关性(P>0.05)，因此可认为，地理环境、日龄、品种可作为影响鸡感染住白细胞虫的风险因素，而其中起主要作用的关键风险因素是地理环境因素。

3.3 系统发育进化树的分析 进化树分析结果表明，本试验中的住白细胞虫可大致分为两大支，其中NJ47、ZT41、ZT47、LC57所检测到的卡氏住白细胞虫与韩国、日本、印度等国家中家禽身上检测到的卡氏住白细胞虫以65%的置信度聚为同一大分支，并与HH5以100%的置信度聚为一支；LC34、LC58、NJ57、NJ2以100%的置信度与马来西亚的卡氏住白细胞虫单独聚为另一大分支。结果显示，云南地区的鸡中所检出的住白细胞虫与卡氏住白细胞虫进化支亲缘关系最为接近，且与亚洲地域流行虫株相近。但由于本次调查中，采集并检测到感染住白细胞虫的样本数量较少，因此，不排除还存在其他亲缘相近的虫种进化支的可能。

4 防治

本病目前虽有学者Ito等[23]研发了表达重组R7抗原的转基因马铃薯叶的口服疫苗，但耐药性的问题需进一步研究，因此，目前没有商品化的疫苗用于防控，对该病的防控只能通过阻断传播途径即消灭传播媒介(库蠓和蚋)和提高养殖场的饲养管理水平来降低发病率[24]。对该病有较好的治疗效果的药物是磺胺类药物(如磺胺二甲氧嘧啶、磺胺氯丙嗪钠、磺胺喹噁啉等都是防治本病的首选)[25]。