马流产沙门菌噬菌体vB-SabS-Sds2的分离鉴定及生物学特性

宋 鹏，赵付伟，刘文强 , 王本琢，刘文华，张 灿，邹 玲，任慧英

(1.青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109；2.东阿阿胶股份有限公司黑毛驴研究所，山东 聊城 252200；3.聊城大学农学院，山东 聊城 252200；4.山东省无棣县畜牧兽医站，山东 无棣 251900)

沙门菌(Salmonella)是革兰阴性菌，在自然界中广泛分布，是最为常见的食源性病原菌,全球每年因沙门菌引发的食物中毒事件位居细菌性中毒事件首位[1]。沙门菌可引起人兽共患疾病，人感染沙门菌会引起胃肠炎，出现腹痛、腹泻、恶心、呕吐等症状。在养殖业中沙门菌会引起猪、羊、鸡、马等多种动物患病[2]。在驴、马等马属动物的养殖过程中，马流产沙门菌是沙门菌病的主要病原体，可以引起妊娠母马流产，同时病原菌会随羊水、胎儿、阴道分泌物大量排出体外。病菌可通过被污染的饮水和饲料经消化道传播，也会通过交配的过程传播[3]。冯培祥等[4]报道从1头流产驴驹的肝脏、脾脏和肺脏、心脏及肾脏中分离到大量沙门菌，确定其为母驴流产的原因。每年因沙门菌感染引起的马属动物流产给养殖业造成巨大的经济损失。

近些年来，由于抗生素的滥用，具有多重耐药性的沙门菌越来越多，成为食品安全和动物疾病控制领域的一个新兴的严重问题。源自猪和家禽的抗生素抗性基因可通过人兽共患病原体的转移而威胁人类健康，并且食源性病原体中抗生素耐药性的出现频率增加[5]。赵翔等[6]报道1株多重耐药的食源性伤寒沙门菌，对20 种抗生素中的 16 种均有耐药性，耐药率达80%。现在大多数发达国家禁止使用抗生素作为动物饲料中的生长促进剂，我国也明确表示药物饲料添加剂将在2020年全部退出[7]。因此，现阶段迫切需要寻找一种新型的抗菌制剂来应对沙门菌病。

噬菌体具有特异性与高效性，可以快速杀伤特定的目标菌，从而避免产生广谱抗生素对肠道正常菌群的杀伤作用，并且噬菌体对具有多重耐药性的细菌同样具有裂解作用，对人体、动物体以及环境不会造成危害。近年来噬菌体治疗越来越受到重视[8]。本试验对马流产沙门菌噬菌体进行分离、纯化，并测定其生物学特性，为探究噬菌体治疗驴沙门菌感染提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本及菌种 分离噬菌体的样本为养驴场的驴粪；马流产沙门菌，由东阿阿胶股份有限公司黑毛驴研究所及聊城大学惠赠；鸡源沙门菌，由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 马流产沙门菌噬菌体的分离鉴定 以马流产沙门菌分离株为宿主菌，取驴粪样加入到200 mL LB肉汤之中，再加入马流产沙门菌500 μL，混匀后37 ℃过夜培养，取上清10 000 r/min离心15 min，取上清过滤。然后将100 μL滤液与100 μL菌液混合，37 ℃孵育5 min，加入到上层琼脂培养基混匀后铺到底层琼脂上，过夜培养，观察噬菌斑。

抠取单个噬菌斑，放入1 mL的LB肉汤之中，37 ℃水浴10 min，然后10 000 r/min离心5 min，取上清过滤进行10倍倍比稀释至合适的稀释度，通过双层平板法[9]进行噬菌斑的纯化，连续纯化3次，获得大小、形态一致的噬菌斑。

1.2.2 噬菌体电镜观察 取20 μL噬菌体液滴加在铜网上，沉淀15 min以后用滤纸吸去多余的液体，滴加15 μL 2%的磷钨酸染色液，染色5 min，吸出多余染液，干燥后用电子显微镜观察[10]。根据命名原则对噬菌体进行命名[11]。

1.2.3 噬菌体裂解谱的测定 采用点样法[12]进行裂解谱的测定，取100 μL菌液加入到5 mL上层琼脂培养基混匀后铺到琼脂平板上,凝固后取噬菌体增殖液2 μL点到双层平板上，37 ℃培养，观察噬菌斑，计算裂解谱。

1.2.4 噬菌体感染复数(MOI)的测定 将噬菌体与宿主菌分别按照不同MOI混合后，加入装有5 mL LB的试管中，在37 ℃振荡培养至澄清后取出，然后10 000 r/min离心5 min，取上清过滤后进行10倍倍比稀释至合适的稀释度，双层平板法测噬菌体效价。

1.2.5 噬菌体对紫外线的稳定性 取4 mL的噬菌体增殖液置于紫外灯下40 cm处照射，每10 min取200 μL噬箘体增殖液，然后进行稀释，用双层平板法测效价。根据效价随时间的变化绘制变化曲线。

1.2.6 噬菌体对氯仿的稳定性 向5 mL噬菌体增殖液之中加入200 μL的氯仿，同时设对照组，加入等量的LB。在37 ℃摇床中振荡培养30 min，双层平板法测效价。

1.2.7 噬菌体对温度的稳定性 取200 μL的噬箘体液，分别在37、40、50、60、70 ℃和80 ℃水中放置20、40 min和60 min。双层平板法测定效价，根据不同的时间温度绘制效价的变化曲线。

1.2.8 噬菌体的pH稳定性 取噬菌体增殖液500 μL 加入到4.5 mL不同pH的LB肉汤中，在37 ℃ 分别作用1、2 h和3 h后将pH调回7.0，双层平板法测效价。绘制噬菌体效价在不同pH下随时间的变化曲线。

1.2.9 一步生长曲线的测定 按MOI为10,各取200 μL的噬菌体液与菌液混合，37 ℃孵育5 min，取出后高速离心弃上清，用LB洗涤高速离心的混合物，重复2次。然后置于含有5 mL LB肉汤之中37 ℃ 振荡培养，同时开始计时，在第1小时每隔5 min，第2小时每隔20 min，第3～4小时每隔30 min，取出200 μL噬菌体增殖液，10 000 r/min离心5 min后取上清稀释，双层平板法测效价，绘制效价随时间的变化曲线。

1.2.10 噬菌体对病原菌的体外裂解试验 按照MOI为10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1和0.000 01比例各取50 μL的菌液与噬菌体增殖液加入到96孔板之中，同时设立阴性对照与阳性对照。37 ℃培养，前3 h每隔30 min，后6 h每隔1 h取样。读取OD630值，以时间为横坐标，OD630值为纵坐标绘制曲线。

2 结果

2.1 噬菌体的分离 以马流产沙门菌S2为宿主菌进行噬菌体的分离，分离到1株噬菌体。经过3代纯化，噬菌体在双层平板上形成直径2 mm左右的透明规则噬菌斑(图1)。噬菌体效价为2.8×109PFU/mL。

图1 噬菌体的噬斑

2.2 噬菌体电镜观察 该噬菌体电镜下观察为长尾噬菌体，由头部和尾部组成，头部直径约为80 nm，尾部约为160 nm。根据噬菌体命名规则，将该株噬菌体命名为vB-SabS-Sds2。

2.3 噬菌体裂解谱的测定 分离到的噬菌体vB-SabS-Sds2，对3株马流产沙门菌的裂解率为100%，对17株鸡白痢沙门菌裂解率为6%，对5株其他鸡源沙门菌均不可裂解。

2.4 噬菌体最适MOI的测定 由图2可知，MOI为0.000 1时，噬菌体侵染宿主菌后裂解产生子代噬菌体效价最高，达到3.23×109PFU/mL，噬菌体vB-SabS-Sds2的最适MOI为0.000 1。

图2 vB-SabS-Sds2的MOI 测定结果

2.5 噬菌体对紫外线的稳定性 噬菌体效价为109PFU/mL时，经过紫外线连续照射20 min后，噬菌体效价下降大约1个数量级，连续照射60 min后，噬菌体效价下降大约2个数量级，保持在107PFU/mL。连续照射120 min后，噬菌体效价跌至2.03×105PFU/mL。

2.6 噬菌体对氯仿的稳定性 经5%氯仿作用30 min后，对照组的效价为1.9×109PFU/mL，试验组的效价为9×108PFU/mL。噬菌体的活性基本不受氯仿影响。

2.7 噬菌体不同温度稳定性试验 噬菌体效价为2.9×109PFU/mL时，噬菌体在温度40 ℃和50 ℃时作用1 h仍能保持原有活性。60 ℃作用1 h后效价下降到1.17×106PFU/mL。70 ℃作用1 h后效价下降到4×104PFU/mL。80 ℃作用20 min已经完全失活。

2.8 噬菌体的pH稳定性 噬菌体效价为2.6×109PFU/mL时，噬菌体在pH为4～11时作用3 h后基本可以保持原有的活性；在pH为2时作用1 h 就完全失活；在pH为3时作用1 h效价降至2.85×104PFU/mL，2 h完全失活；在pH为13时作用3 h完全失活。

2.9 一步生长曲线 噬菌体vB-SabS-Sds2的一步生长曲线如图3所示。潜伏期为10 min，爆发期为30 min，爆发量为8.6 PFU/cell。80 min之后效价趋于稳定，稳定在109PFU/mL左右。

图3 噬菌体vB-SabS-Sds2的一步生长曲线

2.10 噬菌体对病原菌的体外裂解试验 阳性对照组(只加菌液)的OD630值始终持续上升，阴性对照组(只加噬菌体)的OD630值始终保持不变。噬菌体与宿主菌按照不同的感染复数混合后，出现不同程度的细菌增殖抑制现象。感染复数越大，OD630值下降越快，MOI为10时，细菌OD630值下降最快，并保持9 h内不再浑浊(图4)。

图4 噬菌体vB-SabS-Sds2的体外裂解试验

3 讨论

由于噬菌体能特异高效的裂解细菌，因此具有广阔的应用前景，可能取代抗生素来治疗细菌性疾病[13]。在临床应用时，由于噬菌体的高度特异性，为了保证噬菌体治疗的效果，往往将多个具有宽裂解谱的噬菌体配伍，制成噬菌体鸡尾酒制剂来用于治疗[8]。本试验分离的噬菌体对分离到的3株马流产沙门菌均能裂解，裂解率达到了100%，由于噬菌体的高度特异性，该株噬菌体对鸡源的沙门菌裂解能力不强，22株菌中仅可裂解1株。

在噬菌体制剂的实际应用过程中不同的温度、pH和紫外线会对噬菌体的活性产生影响，对不同温度、pH和紫外线的耐受程度是评价噬菌体临床应用价值的重要指标[14]。噬菌体vB-SabS-Sds2在40 ℃与50 ℃时均可保持原有的效价，效价变化不大。在60 ℃下作用1 h，效价下降了3个数量级，70 ℃时经过1 h噬菌体仍可保持效价在105PFU/mL左右，在80 ℃时该噬菌体彻底失活。由于在实际应用过程中现实环境不会达到这么高的温度，因此室温基本不会对噬菌体vB-SabS-Sds2造成影响[15]。该噬菌体在pH为3～13时可保持基本稳定，在pH为3时作用1 h效价仍可保持在104PFU/mL。相比较于李涵依等[16]报道的鸡白痢沙门菌O12噬菌体(在pH为5～7时保持稳定，温度50 ℃以下时保持稳定)，该噬菌体的适用范围更广。为了保护噬菌体在酸性环境中的活性，Atterbury等[17]建议噬菌体制剂在临床应用过程中可与CaCO3配合使用以减少胃酸对噬菌体的影响。该噬菌体经过紫外线照射2 h之 后，效价可保持在105PFU/mL，表明噬菌体vB-SabS-Sds2对紫外线较为敏感。不同的噬菌体增殖周期不同，裂解周期短的噬菌体能更好地控制细菌增殖[18]。该噬菌体潜伏期为10 min，相较于包红朵等[8]报道的噬菌体PA13076的潜伏期20 min，该噬菌体潜伏期更短，能更加迅速的裂解细菌。

2006年以来，欧盟各国已经全面禁止在饲料中添加抗生素，2016年农业部发布了第2428号公告,公告决定停止硫酸黏菌素用于动物促生长，2017年农业部印发了《全国遏制动物源细菌耐药行动计划(2017—2020年)》，药物饲料添加剂将在2020年全部退出；2018年农业农村部又组织制定了《兽用抗菌药使用减量化行动试点工作方案(2018—2021年)》，既要做到饲料端禁抗,又要做到养殖端减抗[19]。饲用抗生素的禁用是必然的发展趋势,“替抗日粮”、“无抗日粮”已成为行业热点之一[20]。噬菌体作为一种生物制剂可以高效的特异性裂解宿主菌，并且不会对其他正常细菌造成任何的负面影响[21],噬菌体治疗成为替代抗生素治疗细菌感染的一种新的治疗方式。马流产沙门菌能引起马、驴等动物发生沙门菌导致的流产，能引起地方性流行，易感性马群、驴群一旦传入此病，则可引起母马及母驴暴发性大批流产，造成巨大的损失[22]。本试验筛选出的噬菌体vB-SabS-Sds2宿主谱广，增殖迅速，在治疗马流产沙门菌或其他沙门菌感染方面具有巨大的潜力。