UFLC-MS/MS法同时测定黄芪桂枝五物汤中4个活性成分的含量

崔 悦，高 兴，韩丽琴，范琢玉，汤鑫淼，冯 波，关 皎，朱鹤云

(吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013)

黄芪桂枝五物汤是国家中医药管理局公布的第一批经典名方，来源于汉代张仲景所著的《金匮要略》，主治血痹症[1]。此方由5味药材(黄芪、桂枝、芍药、大枣和生姜)煎煮而成。药理研究表明，黄芪桂枝五物汤具有保护心脑血管、镇痛等作用，也可治疗中风后遗症、脑梗[2-6]。作为治疗血痹症的经典名方，十分有必要将其拓展到兽医兽药领域进行开发利用，以治疗由风寒湿热等造成的动物关节麻木、沉重等症状，避免由于动物行动不便、活动受限给畜牧业造成的经济损失。此方配伍明确，其中黄芪主要活性成分包括皂苷类(如：黄芪甲苷)和黄酮类(如：毛蕊异黄酮苷)，具有保护神经、心血管等作用[7-9]；桂枝主要成分包括有机酸等(如：桂皮酸)，具有抗病毒、抗炎等作用[10-12]；芍药中的主要成分包括单萜苷类(如：芍药苷、芍药内酯苷)，抗炎作用明显[13-15]。目前，已有文献采用高效液相色谱(HPLC)方法测定黄芪桂枝五物汤成分含量，但其分离时间较长，灵敏度较低[16-18]。本课题组前期采用超快速液相色谱(UFLC)技术建立了同时测定黄芪桂枝五物汤中4个活性成分(毛蕊异黄酮、桂皮酸、芍药苷和芍药内酯苷)含量的方法，分析时间为18 min[19]。本试验在前期研究的基础上，采用超快速液相色谱-串联质谱法(UFLC-MS/MS)技术同时测定上述4种成分，检测灵敏度大幅提高，且分析时间仅为11 min，对于提高黄芪桂枝五物汤及其制剂在兽药行业的质量标准具有积极意义。

1 材料与方法

1.1 仪器 3200 QTRAP质谱仪(美国AB Sciex)，Prominence UFLC型超高快速液相色谱仪(日本岛津)，旋转蒸发仪(日本EYELA)。

1.2 试药 毛蕊异黄酮苷对照品(批号：18092601)、桂皮酸对照品(批号：180621)、芍药苷对照品(批号：20030901)、芍药内酯苷对照品(批号：19121705)，均购自成都普菲德生物技术有限公司。乙腈和甲醇为色谱纯(美国Fisher)。黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根，桂枝为樟科植物肉桂CirmarnomumcassiaPresl的干燥嫩枝，芍药为毛莨科植物芍药PaeonialactifloraPALL.的干燥根，生姜为姜科植物姜ZingiberofficinaleRose.的新鲜根茎，大枣为鼠李科植物枣ZiziphusJujubaMill.的干燥成熟果实，上述药材均购自吉林大药房，经吉林医药学院药学院李景华副教授鉴定，均为道地药材。

1.3 色谱与质谱条件

1.3.1 色谱条件 采用Shim-Pack XR-ODS色谱柱(75.0 mm×3.0 mm，2.2 μm)，流动相0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～6 min，12%→25%B；6～7 min，25%→45%B；7～11 min，45%→60%B)，平衡时间为5 min，流速为0.4 mL/min，柱温35 ℃，进样量为5 μL。

1.3.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子源(ESI源)，负离子方式检测，雾化气、气帘气压力分别为55 psi、25 psi；多重反应监测(MRM)，用于定量的母离子和子离子分别为m/z491.2→m/z283.1(毛蕊异黄酮苷)、m/z147.0→m/z103.0(桂皮酸)、m/z525.0→m/z121.0(芍药苷)、m/z525.1→m/z121.1(芍药内酯苷)。4个成分的碰撞能量(CE)分别为25、16、37 eV和32 eV。

1.4 溶液的制备

1.4.1 黄芪桂枝五物汤的制备 参照《金匮要略》原文，取黄芪、桂枝、白芍各9 g、生姜18 g、大枣4枚，2次10倍量回流提取，各1 h，合并2次滤液，用旋转蒸发仪浓缩至50 mL。

1.4.2 对照品溶液制备 分别取上述4种对照品，用甲醇制成质量浓度为 1.0 mg/mL的各对照品溶液。

1.4.3 供试品溶液制备 取上述黄芪桂枝五物汤 0.5 mL，加甲醇水溶液(v∶v= 50∶50)25 mL，超声30 min，续滤液经 0.22 μm 微孔滤膜过滤。

1.5 线性关系、检测限和定量限 分别取各对照品溶液适量，用甲醇水溶液(50∶50)配制成系列混合对照品溶液(毛蕊异黄酮苷浓度分别为0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 μg/mL和10.0 μg/mL，桂皮酸浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/mL和25.0 μg/mL，芍药苷浓度分别为2.0、4.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL和100.0 μg/mL，芍药内酯苷浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/mL和25.0 μg/mL。以对照品浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。将毛蕊异黄酮苷、桂皮酸、芍药苷和芍药内酯苷对照品储备液逐步稀释后进样，以信噪比(S/N)为3 考察其检测限，以信噪比(S/N)为10 考察其定量限。

1.6 精密度试验 取毛蕊异黄酮苷浓度为2.0 μg/mL、桂皮酸质量浓度为5.0 μg/mL、芍药苷质量浓度为20.0 μg/mL、芍药内酯苷质量浓度为5.0 μg/mL 的混合对照品溶液，平行测定6份，计算批内精密度；另取上述混合对照品溶液，连续进样3 d，每天测定6份，计算批间精密度。

1.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于供试品溶液制备后0、2、4、8、12 h和24 h(室温下)进样测定。

1.8 重复性试验 取同一批样品6 份，制备供试品溶液进样测定，计算待测成分含量。

1.9 加样回收率试验 取已知含量(毛蕊异黄酮苷含量为0.148 mg/mL，桂皮酸含量为0.112 mg/mL，芍药苷含量为2.952 mg/mL，芍药内酯苷含量为0.454 mg/mL)同一批次黄芪桂枝五物汤样品9份，每份0.25 mL，分别加入相当于样品中4种成分含量的80%、100%、120%的对照品溶液，每一量下各3份。进样5 μL测定，计算回收率和RSD值。

1.10 样品含量测定 称取6批黄芪桂枝五物汤样品，每批样品平行制备3份供试品溶液，进样5 μL，计算4个成分的含量。

2 结果

2.1 质谱与色谱图 4个成分的产物离子扫描质谱图见图1，对照品和样品的MRM色谱图见图2。

图1 毛蕊异黄酮葡萄糖苷(A)、桂皮酸(B)、芍药苷(C)和芍药内酯苷(D)的负离子产物离子扫描质谱图

图2 混合对照品(A)和样品(B)MRM色谱图

2.2 线性关系、检测限和定量限 4个成分的线性回归方程分别为：

Y=4.372×104X+4.092×103r=0.999 9

Y=1.402×104X-1.276×103r=0.999 8

Y=2.425×104X+7.686×104r=0.999 6

Y=3.974×104X+1.782×104r=0.999 5

结果表明，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮酸、芍药苷和芍药内酯苷分别在0.2～10.0 μg/mL、0.5～25.0、2.0～100.0 μg/mL和0.5～25.0 μg/mL线性关系良好。

毛蕊异黄酮检测限和定量限分别为4 ng/mL和13 ng/mL；桂皮酸检测限和定量限分别为167 ng/mL和500 ng/mL；芍药苷检测限和定量限分别为23 ng/mL 和73 ng/mL；芍药内酯苷检测限和定量限分别为14 ng/mL和44 ng/mL。

2.3 精密度试验 4个成分的批内精密度(RSD)分别为1.4%、2.4%、1.3%和2.0%，批间精密度(RSD)分别为2.3%、2.6%、1.2%和1.5%，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验 4个成分的RSD分别为2.2%、2.2%、0.5%和1.2%，说明毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮酸、芍药苷和芍药内酯苷在24 h内稳定。

2.5 重复性试验 4个成分的重复性结果见表1。

表1 黄芪桂枝五物汤中毛蕊异黄酮苷、桂皮酸、芍药苷和芍药内酯苷的重复性试验结果

2.6 加样回收率试验 结果见表2。

表2 黄芪桂枝五物汤样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮酸、芍药苷和芍药内酯苷的回收率

2.7 含量测定 6批样品测定结果见表3。黄芪桂枝五物汤中4个活性成分进行含量测定，其含量高低顺序如下：芍药苷>芍药内酯苷>毛蕊异黄酮葡萄糖苷>桂皮酸。

表3 黄芪桂枝五物汤中毛蕊异黄酮苷、桂皮酸、芍药苷和芍药内酯苷的含量

3 讨论

目前文献报道的HPLC法测定黄芪桂枝五物汤成分含量的相关方法测定成分较少、分离时间较长、灵敏度较低[16-18]；与已有的LC-MS法测定黄芪桂枝五物汤成分含量的方法相比[20]，本试验测定的成分更多、分析时间更短，优势明显。本课题组前期采用UFLC法同时测定了黄芪桂枝五物汤中毛蕊异黄酮、桂皮酸、芍药苷和芍药内酯苷的含量[19]。本试验在此基础上，采用UFLC-MS/MS技术对上述4个成分进行测定。

首先对供试品溶液的处理方法进行了考察。前期UFLC法中采用甲醇溶剂提取得到供试品溶液，本试验中分别考察了甲醇、甲醇水溶液(v∶v=50∶50)和水对供试品溶液提取效果的影响，结果表明，在本试验条件下，甲醇水溶液(v∶v=50∶50)提取效果最好，故最终以其作为供试品溶液的提取溶剂。

分别考察了不同种类水相和有机相对分离效果的影响，考虑到非挥发性溶剂会对质谱系统造成伤害，故本试验流动相中以甲酸替代前期UFLC方法中的磷酸水溶液，通过对不同浓度的甲酸进行考察，最终选择乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相，可获得较好的分离效果。通过对洗脱程序优化，最终确定梯度洗脱(0～6 min，12%→25%B；6～7 min，25%→45%B；7～11 min，45%→60%B)，平衡5 min可获得较好的分离效果且分析时间较短。4个待测物在(ESI源)负离子检测模式下的响应更佳。4个成分形成的加合离子如下：毛蕊异黄酮苷m/z491.2[M+HCOO]-，桂皮酸m/z147.0[M-H]-，芍药苷m/z525.0[M+HCOO]-，芍药内酯苷m/z525.1[M+HCOO]-。通过对不同碰撞能量(CE)进行优化发现，能量较低时碎片离子数量少但稳定，能量高时则相反。综合考虑，毛蕊异黄酮苷、桂皮酸、芍药苷和芍药内酯苷CE值分别为25、16、37 eV和32eV，此时可获最佳检测效果。

4 展望

血痹症是一种危害很大的病症，不仅会危害人类健康，也会危害动物的健康，甚至给畜牧产业造成巨大的经济损失。黄芪桂枝五物汤作为治疗血痹症的经典名方，可望在兽医兽药领域应用和开发。本试验建立的UFLC-MS/MS方法可为黄芪桂枝五物汤制剂的质量标准提供参考。