斑马副蛔虫线粒体cox1和nad5基因序列多态性

贺名叶，谢 旖，田世成，张卓亿，刘 伟

(1.湖南省益阳职业技术学院，湖南 益阳 413055；2.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128)

马副蛔虫(Parascarisequorum,P.equorum)和Parascarisunivalens是已知寄生于马肠道内最大的线虫，其感染均可导致宿主生长缓慢、腹泻、贫血等，严重时宿主因肠梗塞而死亡[1]。长期以来，国内外许多学者根据马副蛔虫和Parascarisunivalens的形态学特征、基因组特征和生理生化等特点对其进行比较，得到的结果存在较大差异，导致这两种线虫是否为同一个种存在较大的争议[2-5]，如Nielsen等[4]调查结果认为两者为不同种，因为其染色体数目存在差异；而Gao等[3]以线粒体全基因序列分析马副蛔虫与P.univalens之间同源性，发现两者线粒体全基因组核苷酸序列同源性达99.1%～99.9%，提示马副蛔虫与P.univalens为异名同种。

对寄生虫进行治疗或进一步研究的前提是对其进行准确鉴定，但马属动物可感染两种大型蛔虫，分别为马副蛔虫和Parascarisunivalens，两者之间形态学特征差异小，导致传统的形态学鉴定手段有一定的局限性。线粒体DNA具有进化速度快和母系遗传等特征，利用线粒体DNA(或部分基因序列)作为分子标记应用于马属蛔虫的分类鉴定和遗传进化等研究十分常见[3-5]。本试验采用PCR对斑马粪便中获得的9株蛔虫样品的线粒体细胞色素基因部分序列I(pcox1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶第5亚基基因部分序列(pnad5)进行扩增，分析其基因序列的同源性及遗传进化关系，为斑马源蛔虫的分子鉴定和分子流行学等研究提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 虫株来源 2017年长沙市生态野生动物园对园区内部分草食动物进行药物驱虫，先后在9匹斑马粪便中发现线虫，形态学初步鉴定为蛔虫属，用灭菌PBS清洗后分别标记，保存于-20 ℃。

1.2 主要试剂 组织DNA提取试剂盒，购自美国赛默飞公司；蛋白酶K，购自德国Merck公司；PCR试剂和DL-2 000 DNA marker，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 线粒体pcox1与pnad5基因扩增与测序 根据参考文献[6-7]设计扩增蛔虫线粒体pcox1和pnad5基因序列的引物序列：pcox1-F：5′-TTAGTT-TCTTTTCCTCCGCT-3′，pcox1-R：5′-TAAAGAAAGA-ACATAATGAAAATG-3′；pnad5-F：5′-TAG AGGGG-CTATGAATACTG-3′，pnad5-R：5′-ACGGCCATCTTGTTGACCTAATG-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

将虫体反复清洗，剪取约1.5 cm虫体按照组织DNA提取试剂盒说明书提取虫体核酸DNA，保存于-80 ℃。以基因组DNA为模板分别扩增线粒体pcox1和pnad5基因序列，PCR扩增体系(50 μL)：PCR Mix 25 μL、上下游引物 2 μL(10 pmol/L)、模板DNA 4 μL和灭菌蒸馏水17 μL。扩增条件:94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1.2%凝胶电泳检测并由长沙擎科生物科技有限公司测序。

1.4 线粒体pcox1和pnad5基因序列分析 应用DNASTAR软件对获得的序列进行拼接，从GenBank下载具有代表性的蛔目线粒体cox1和nad5基因序列，利用MegAlign软件分析斑马蛔虫pcox1、pnad5序列与其他蛔虫分离株对应核苷酸序列同源性；应用DnaSP 5.0软件分析序列核苷酸多样性(Pi)、单倍型多样性(Hd)、单倍型数(H)、平均核苷酸差异(K)等特性；以旋毛虫(Trichinellaspiralis)作为外群，采用K2P模型，利用MEGA 7.0软件中邻接法(Neighbor joining，NJ)构建种系发育树，并重复1 000次 自举检验(Bootstrap test)。

2 结果

2.1 PCR扩增 本试验中9个斑马蛔虫样品(样品编号为BM1～9)均扩增出约450 bp和528 bp的基因片段，与预期线粒体pcox1和pnad5基因序列大小相符(图1)，表明分别扩增出斑马蛔虫线粒体pcox1和pnad5序列。

图1 斑马蛔虫线粒体pcox1(A)与pnad 5(B)基因序列的PCR扩增结果

2.2 斑马源蛔虫线粒体pcox1和pnad5基因序列特征与同源性分析 将斑马蛔虫线粒体pcox1和pnad5基因序列的测序结果经校正并剔除多余序列后，9个斑马蛔虫分离株扩增的线粒体pcox1和pnad5基因序列长度分别为422 bp和528 bp，占cox1和nad5基因序列全长的26.74%(422/1 578)和33.31%(528/1 585)，未检测到核苷酸插入或缺失，序列中A+T平均含量分别为62.32%(263/422)和65.15%(344/528)。

同源性分析结果显示，本试验中9个斑马蛔虫样品线粒体pcox1和pnad5基因序列之间的同源性分别为99.3%～100.0%和98.1%～99.5%，与GenBank中登录的马副蛔虫分离株(MK209654.1和MK209665.1)同源基因序列相似性分别为99.5%～100.0%(pcox1)和97.6%～99.8%(pnad5)，与P.univalens分离株(KM067271.1)同源基因序列相似性分别为99.2%～100.0%(pcox1)和97.9%～99.3%(pnad5)，与其他蛔虫同源基因序列相似性均低于92.0%(pcox1)和91.2%(pnad5)。

2.3 斑马源蛔虫线粒体pcox1和pnad5基因序列遗传多样性分析 9个斑马源蛔虫样品线粒体pcox1基因序列检测出6个单倍型，共含有8个可变位点，其总单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)分别为0.624和0.004 37，平均核苷酸差异(K)为1.834；而pnad5基因序列检测出8个单倍型，共含有14个可变位点，其总单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)分别为1.000和0.009 67，平均核苷酸差异(K)为4.071。结果表明斑马蛔虫线粒体pcox1基因序列变异程度较pnad5基因低(表1)。

表1 基于线粒体pcox1和pnad 5基因序列分析斑马源蛔虫遗传多样性

2.4 斑马源蛔虫线粒体pcox1和pnad5基因序列系统发育分析 将斑马源蛔虫线粒体pcox1序列(422 bp)和pnad5序列(528 bp)串联，利用MEGA 7.0软件中NJ法构建系统发育树。结果显示，9个斑马源蛔虫分离株与已知马副蛔虫分离株(MK209654和MK209665)、P.univalens分离株聚为同一分支，贝氏蛔虫属(Baylisascarisspp.)聚为另外一个分支，马副蛔虫和P.univalens与贝氏蛔虫属所属分支相距较近，但与其他蛔虫所属分支相距较远(图2)，但本次试验所构建的系统进化树无法区分马副蛔虫和P.univalens。

图2 斑马蛔虫与其他蛔虫线粒体pcox1与pnad 5串联基因核苷酸序列系统进化分析

3 讨论

马副蛔虫病是马、驴等动物常见的寄生虫病，可导致宿主出现严重的临床疾病，甚至死亡[5]。马副蛔虫在我国新疆、内蒙古等养马业发达地区分布广泛。魏梓霖等[8]调查结果显示，我国部分地区赛马马副蛔虫感染率达4.83%，其结果与图尔荪·萨迪尔等[9]对新疆阿勒泰地区马匹马副蛔虫感染情况基本一致，虽然其感染率相对较低，但该病对宿主危害巨大，是我国马养殖过程中应重点防控的寄生虫病之一。然而，目前对于马副蛔虫病的研究主要集中于流行情况调查与药物防控等研究，对该类寄生虫的种类鉴定与遗传进化研究较少。

在生物进化过程中，生态环境变化可能导致寄生虫发生遗传变异，而传统的形态学鉴定无法判定虫株是否发生遗传变异。线粒体DNA具有进化速率快和母系遗传等特点，可作为可靠的分子标记应用于寄生虫的遗传进化研究中。大量研究表明，蛔虫线粒体cox1与nad5基因序列在种内相对保守，但也存在一定的遗传变异[10-14]。本试验通过对9个斑马源蛔虫样品线粒体pcox1和pnad5基因序列进行扩增与分析，发现其同源性分别为99.3%～100.0%和98.1%～99.5%，与GenBank中收录的马副蛔虫分离株基因序列相似性分别为99.5%～100.0%(pcox1)和97.6%～99.8%(pnad5)，与P.univalens分离株基因序列相似性分别为99.2%～100.0%(pcox1)和97.9%～99.3%(pnad5)，且基于pcox1和pnad5串联基因序列构建的进化树分析结果显示，所有的斑马源蛔虫样品与已知马副蛔虫和P.univalens聚为同一分支，与其他蛔虫所属分支相隔较远。结果表明斑马源蛔虫为马副蛔虫或P.univalens，同时也支持马副蛔虫与P.univalens为同一个种的观点[3]，与Peng等[5]调查结果有一定差异，出现不同结果原因可能与构建系统进化树所选择的分子标记不同有关。

本试验对9个斑马源蛔虫样品线粒体cox1和nad5基因部分序列进行扩增与分析，发现斑马源蛔虫pcox1和pnad5基因序列均存在一定的遗传变异情况，且pnad5遗传多样性高于pcox1，但二者均较低。进一步试验结果将斑马源蛔虫鉴定为马副蛔虫或P.univalens，可初步确定马副蛔虫和P.univalens为同一个种，但这两种线虫是否为同一个种还需要进一步研究，如通过分析马副蛔虫和P.univalens全基因组序列信息等。