四君子汤通过影响TNF-α、IL-6干预脾虚大鼠胃黏膜损伤的实验研究*

周克平 宋文龙 肖林秀 吴芳芳

（1浙江省杭州市建德市中西医结合医院 建德 311600；2浙江省杭州市建德市第一人民医院 建德 311600）

中医学认为，脾居于人体中焦，为“中央之土”，主运化，为气血生化之源，五脏六腑气机升降出入赖之维持。人体生理机能的正常运转，有赖于脾胃将摄入的营养物质化为精微，吸收转输至全身，维持人体内外平衡，抵御病邪。有研究[1~4]表明，脾虚状态下，致伤因子造成胃黏膜损伤，当损伤超过机体原有防御及修复功能时，胃黏膜屏障作用发生紊乱，出现病理性损伤。

四君子汤是益气健脾的代表方剂，来源于宋代《太平惠民和剂局方》，由党参、白术、茯苓和甘草组成，临床用于治疗脾气虚证引起的食欲不振、脘腹虚胀等不良症状[5~7]。本研究通过复制大鼠脾虚模型，观察四君子汤对脾虚大鼠胃黏膜损伤和炎症介质表达的影响，并与临床常用胃黏膜保护剂（枸橼酸铋钾）进行比较，分析脾虚与胃黏膜屏障功能改变之间的相关性，以期从胃黏膜损伤变化的角度出发，探讨四君子汤治疗脾虚大鼠的作用机制。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠，10周龄，体质量330~360 g，共50只，购自上海斯莱克实验动物有限公司[许可证号：SCXK（沪）2017-0005；合格证号：20170005023335]。试验前饲养在动物房环境中适应1周后开始进行造模及后续试验。

1.2 药物及试剂 小承气汤由厚朴、枳实、大黄（比例3:3:2）组成；四君子汤由党参、白术、茯苓、甘草（比例2:2:2:1）组成，均由医院药剂科提供，并由制剂室煎取后[8]，70℃的条件下旋转蒸发，浓缩至220 ml，即得到浓缩液每毫升含生药量1.0 g。灭菌注射用水（国药准字H41024240）、枸橼酸铋钾片（国药准字H10920098，使用灭菌注射用水配置成浓度为1 800 mg/L含药溶液）、生理盐水（国药准字H20013310，使用灭菌注射用水配置成浓度为1 800 mg/L含药溶液）；Rat IL-6 ELISA试剂盒，联科生物，货号EK306/3-48；Rat TNF-αELISA试剂盒，联科生物，货号EK382/3-48。

1.3 仪器 全波长酶标仪，SpectraMax Plus 384型，美国MD；离心机，L3-800R低速冷冻离心机，采购自湖南湘仪。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠分组及模型建立50只大鼠常规饲喂l周后随机分为空白对照组、脾虚模型组、自然康复组、四君子汤组和西药组（枸橼酸铋钾），各10只。除空白对照组外，其余4组均制作大鼠长期脾虚模型。脾虚模型组大鼠小承气汤3 ml/（次·只）灌胃，隔日1次，同时隔日喂食，共24周[9~10]。

1.4.2 给药 空白组大鼠常规饲喂，并采用生理盐水3 ml/次，隔日1次进行灌胃，持续24周；脾虚模型组大鼠每2天喂食1次，模拟饥饱失节，联合小承气汤3 ml/次灌胃，隔日1次，共24周；自然康复组大鼠前20周饲喂与脾虚模型组一致，20周后予常规饲养，共24周；四君子汤组饲喂前20周同脾虚模型组，20周后改常规饲喂，并予四君子汤（4 ml/次）连续灌胃4周，1次/d；西药组饲喂前20周同脾虚模型组，20周后改常规饲喂，按13.5 mg/kg（3 ml）给予枸橼酸铋钾灌胃，连续灌胃4周，1次/d。均于实验24周末处死大鼠进行取材处理。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 脾虚大鼠成模评价 通过对各组大鼠造模前后的行为变化、体质量、毛色、精神状态、大便性质进行对比和分析。

1.5.2 ELISA检测 （1）肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平检测：使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温。制备标准品，依次倍比稀释成300.00 pg/ml、150.00 pg/ml、75.00 pg/ml、37.50 pg/ml、18.75 pg/ml、9.38 pg/ml、4.69 pg/ml，标准品稀释液（0 pg/ml）直接作为空白孔。加样，预设7个标准孔，按浓度梯度分别加入100μl标准品。空白孔则仅加入100μl试剂稀释液，其余各孔则分别加入样品10μl及检测缓冲液90μl。检测抗体，每孔加入50μl经稀释抗体。封板后以300 r/min下震荡，室温孵育2 h。弃孔内液体，以350μl的洗涤液重复洗6次后吸水纸上拍干。每孔加入100μl稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素后封板，300 r/min下震荡孵育45 min。弃孔内液体，以350μl的洗涤液重复洗6次后吸水纸上拍干。上述步骤完成后每孔加TMB底物溶液100μl，避光显色5~30 min，最后在每孔加终止溶液100μl，终止反应。在酶标板底无水滴、无气泡后，用酶标仪在450 nm波长和630 nm波长测量各孔的光密度值（OD值）。（2）白细胞介素-6（IL-6）水平检测：使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温。制备标准品，依次倍比稀释成2 000.00 pg/ml、1 000.00 pg/ml、500.00 pg/ml、250.00 pg/ml、125.00 pg/ml、62.50 pg/ml、31.25 pg/ml，标准品稀释液（0 pg/ml）直接作为空白孔。其余步骤同TNF-α检测。

1.5.3 采用Guth法评价大鼠胃黏膜的溃疡指数摘下全胃，10 min后沿胃大弯剖开，用冰生理盐水冲洗，再平展于滤纸上，全胃各病灶长度之和为损伤指数，以mm表示。损伤≤1 mm（包括糜烂点）为1分；1 mm＜损伤≤2 mm为2分；2 mm＜损伤≤3 mm为3分；3 mm＜损伤≤4 mm为4分；＞4 mm为5分；损伤宽度＞2 mm者胃黏膜溃疡指数（UI）加倍。

1.5.4 病理改变观察 取大鼠胃经石蜡包埋后组织切片，常规HE染色，镜下观察病理改变情况。

1.6 统计学方法 所得数据采用SPSS22.0软件进行分析。各样本均数间以单因素方差分析，多个样本均数间两两比较，采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 五组一般情况及体质量比较 （1）一般情况：空白对照组毛色、精神状态及活动情况均良好；造模后（20周）造模四组均出现毛较凌乱，精神状态及活动情况较萎靡，大便时有稀溏等情况；24周后，脾虚模型组毛较凌乱、精神状态及活动情况较萎靡，自然康复组毛一般、精神状态及活动情况尚可，西药组及四君子汤组毛一般、精神状态及活动情况尚可，大便性质尚正常。（2）体质量变化：造模前，各组大鼠间体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），有可比性。造模后，各组大鼠体质量较前均有所升高，其中空白对照组[（421.60±56.89）g]及自然康复组[（402.00±25.80）g]较前升高较明显，但各组间差异无统计学意义（P＞0.05），与造模前比较，差异也无统计学意义（P＞0.05）。24周后，空白对照组[（523.40±61.65）g]、四君子汤组[（508.20±27.33）g]及西药组[（486.40±45.32）g]与脾虚模型组[（418.6±44.62）g]比较，体质量有明显上升，且差异有统计学意义（P＜0.05）；而自然康复组体质量（459.40±17.63）g虽较脾虚模型组有所升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。四君子汤组与西药组大鼠24周时体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 五组大鼠体质量比较（g，±s）

表1 五组大鼠体质量比较（g，±s）

注：与空白对照组相比，#P＜0.05；与脾虚模型组相比，*P＜0.05；与自然康复组相比，△P＜0.05。

组别 n 造模前 造模后（20周） 治疗后（24周）空白对照组脾虚模型组自然康复组四君子汤组西药组10 10 10 10 10 392.80±35.75 383.00±20.45 385.40±29.45 384.60±24.13 386.00±17.44 421.60±56.89 394.40±25.01 402.00±25.80 393.60±11.06 409.00±20.63 523.40±61.65 418.60±44.62#459.40±17.63 508.20±27.33*△486.40±45.32*

2.2 五组TNF-α、IL-6水平比较 与空白对照组比较，脾虚模型组TNF-α、IL-6在血清中表达上调，且有极显著性差异（P＜0.01）；与脾虚模型组相比，自然康复组TNF-α、IL-6含量无明显变化（P＞0.05），提示应激状态下，大鼠胃黏膜内攻击因素明显增强，胃黏膜损伤严重，可能是造成胃黏膜损伤的主要因素。与脾虚模型组相比，四君子汤组及西药组大鼠TNF-α、IL-6表达水平明显下调，且有极显著性差异（P＜0.01）。而相较于西药组，四君子汤组大鼠TNF-α、IL-6表达水平与之相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。结合胃黏膜损伤情况，说明四君子汤对胃黏膜有与枸橼酸铋钾相当的保护和促修复作用。见表2。

表2 五组大鼠TNF-α、IL-6水平比较（pg/ml，±s）

表2 五组大鼠TNF-α、IL-6水平比较（pg/ml，±s）

注：与空白对照组相比，#P＜0.05；与脾虚模型组相比，*P＜0.01；与自然康复组相比，△P＜0.01。

组别 n空白对照组脾虚模型组自然康复组四君子汤组西药组10 10 10 10 10 IL-6 TNF-α 61.40±23.90 766.35±166.62#711.39±140.51#407.18±25.94#*△381.82±33.76#*△164.70±29.50 567.11±29.77#532.00±18.69 227.43±27.09#*△214.44±18.31#*△

2.3 胃黏膜损伤指数观察 空白对照组大鼠胃黏膜组织表面色泽红润，黏膜较为完整，无明显溃疡等损伤，腺体排列整齐、均匀、致密。见图1。脾虚模型组大鼠黏膜下充血明显，且黏膜表面呈现多条条索状出血面。见图2。自然康复组大鼠胃黏膜可见点状及条索状溃疡损伤，程度较模型组减轻；而四君子汤组及西药组大鼠胃黏膜主要表现为充血而条索状溃疡损伤不明显。见图3~图5。与模型组（19.20±7.40）mm相比，四君子汤组（5.20±1.92）mm及西药组（5.00±1.58）mm损伤程度较轻，都存在极显著性差异（P＜0.01），且要优于自然康复组（9.40±3.58）mm，P＜0.05，但两药物治疗组间比较，差异无显著性。表明四君子汤能在一定程度上缓解脾虚大鼠胃黏膜的损伤性溃疡，疗效与枸橼酸铋钾相近。见表3。

图1 空白对照组

图2 脾虚模型组

图3 自然康复组

图4 四君子汤组

图5 西药组

表3 胃黏膜损伤指数（n＝10，mm，±s）

表3 胃黏膜损伤指数（n＝10，mm，±s）

注：与空白对照组比较，▲P＜0.01；与脾虚模型组比较，*P＜0.05，#P＜0.01；与自然康复组比较，△P＜0.05。

组别 空白对照组 脾虚模型组 自然康复组 四君子汤组 西药组Mean SD Mean±SD 0.00 0.00 0.00±0.00 19.20 7.40 19.20±7.40▲9.40 3.58 9.40±3.58▲*5.20 1.92 5.20±1.92▲#△5.00 1.58 5.00±1.58▲#△

2.4 胃组织病理改变HE染色后镜下观察，空白对照组大鼠胃黏膜结构、层次较清楚。见图6。脾虚模型组大鼠胃黏膜变薄，黏膜上皮细胞坏死，呈片状脱落，连续性中断，水肿明显。见图7。自然康复组大鼠胃黏膜部分中断，黏膜、黏膜下层部分水肿，部分可见炎细胞浸润。见图8。四君子汤组大鼠胃黏膜、黏膜下层充血水肿轻，腺体排列整齐，有少量炎细胞浸润。见图9。西药组胃黏膜及黏膜下层稍水肿，腺体排列尚整齐，部分可见炎细胞浸润。见图10。

图6 空白对照组

图7 脾虚模型组

图8 自然康复组

图9 四君子汤组

图10 西药组

3 讨论

中医学理论认为，脾胃为“后天之本、气血生化之源”。脾主运化，胃主受纳，脾气健运，则化源充足，气血津液得以灌溉四旁，阴平阳秘，机体才能生机盎然，四脏亦可安和，即如《金匮要略》所言“四季脾旺不受邪”[11~12]。倘使脾气虚弱，失其健运，不能正常运化水谷，输布精微，则体内气血生化无以为继，脏腑形体长期失养，正气亏虚于内，使人体防御能力不断下降，而容易产生各种病证，特别是容易导致胃内黏膜的损害[5~7]。临床上，大部分慢性疾病后期都会出现倦怠乏力、少气懒言、腹胀纳呆、面色萎黄、大便溏薄、消瘦、舌淡苔白、脉缓弱等脾虚证主要证候。本实验模拟人体常见导致脾虚诱因，以小承气汤灌胃联合饮食失节法建模，造模结束后观察到脾虚模型组大鼠出现皮毛较凌乱、精神状态及活动萎靡，大便时有稀溏等脾虚表现。对大鼠胃黏膜组织进行进一步观察，可见不同程度点状或条索状溃疡损伤，HE染色下，胃黏膜变薄，黏膜上皮细胞坏死，呈片状脱落，连续性中断，水肿明显，提示大鼠造模成功。

正常情况下，胃黏膜对损伤有一定自我修复能力。作为常见细胞因子，TNF-α主要由脂肪组织中单核-吞噬细胞及其他多种细胞产生，不但能够有选择性地杀伤某些肿瘤细胞，对正常细胞无明显毒性，还能在一定程度上发挥对免疫、感染与炎症反应调节作用[13]。近年研究[14~18]表明，TNF-α作为胃黏膜炎症发生发展阶段的重要内源性细胞因子之一，在胃黏膜炎症反应中起到重要作用：（1）提升机体内中性粒细胞的活化、趋化及黏附水平，耗氧量显著增加，产生大量氧自由基，上调局部炎症反应水平；（2）可提高白细胞在血管内皮细胞上黏附性，使内皮细胞受到损伤而启动血管内凝血系统，引起机体局部血液循环障碍，影响到黏膜血氧供给加剧溃疡。此外，高水平的IL-6可以长时间作用于胃黏膜，消耗大量的上皮细胞，引起胃酸分泌减少，削弱了对胃内化学物质的防御能力，有利于有害物质对胃黏膜的侵蚀、损害，也是参与溃疡形成的一个关键性细胞免疫因素[17~21]。曹琰、徐小颖等[22~23]发现，与正常大鼠相比，脾虚大鼠血清中TNF-α、IFN-γ及IL-1、IL-2、IL-6等细胞因子表达显著上调，而健脾类中药能通过改善脾虚大鼠的消化道系统，调节上述细胞因子的分泌，提升机体的免疫功能，发挥健脾益气功效。在本实验中，与空白对照组大鼠相比，脾虚模型组大鼠TNF-α、IL-6水平也表现出上升趋势，与上述研究结果相似，结合脾虚模型组大鼠胃黏膜表现，表明IL-6、TNF-α升高可使大鼠胃黏膜出现实质性损伤。

作为临床常用补气健脾经典方药，四君子汤源出《太平惠民和剂局方》，常用于“荣卫气虚，脏腑怯弱。心腹胀满，全不思食，肠鸣泄泻，秽吐逆……”。人参、白术、茯苓和甘草为其组成药物。本研究通过直接观察，测量并计算大鼠胃黏膜溃疡损伤指数，同时对大鼠胃黏膜病理变化进行对比，发现脾虚大鼠胃黏膜组织可见不同程度点状或条索状溃疡损伤，HE染色下，胃黏膜变薄，黏膜上皮细胞坏死，呈片状脱落，连续性中断，水肿明显。经四君子汤干预后，大鼠胃黏膜及黏膜下层出血、充血、糜烂均轻于脾虚模型组，腺体排列整齐，炎细胞浸润情况减轻，与西药组接近；血清检测结果显示，脾虚证能明显上调TNF-α、IL-6的表达水平，从而降低脾虚大鼠胃黏膜局部损伤修复功能，经四君子汤原方治疗后脾虚大鼠的TNF-α、IL-6明显下降，胃黏膜损伤指数改善，说明四君子汤能通过下调TNF-α、IL-6表达，促进脾虚大鼠黏膜屏障的修复。

综上所述，研究结果部分验证了四君子汤对于防治脾虚患者胃黏膜损伤有重要意义，为临床推广应用该方治疗胃病、预防胃黏膜损伤提供了实验依据。但中药复方对胃黏膜的保护作用是多方面的，还有待于进一步的研究。