肠道细菌产酸克雷伯氏菌及其挥发性物质对斑翅果蝇成虫的引诱效果

郭亚芸, 覃冬云, 史红梅, 吴新颖, 于 毅, 李廷刚,*, 高欢欢,,*

(1. 山东省葡萄研究院, 济南 250100; 2. 山东省农业科学院植物保护研究所, 济南 250100)

斑翅果蝇Drosophilasuzukii隶属双翅目(Diptera)果蝇科(Drosophilidae)，可在樱桃、杨梅、葡萄等60多种水果刚刚成熟时产卵于果皮下，卵孵化后以幼虫蛀食为害，果实逐渐软化以致变褐腐烂，导致产量下降，是较为重要的果树害虫(Goodhueetal., 2011; Milanetal., 2012)。由于斑翅果蝇在世界分布广泛，于2013年被列为检验检疫害虫，因此该虫的防治亟待解决。

肠道微生物在昆虫的营养、生长发育以及适应性方面均有重要的作用(Amietal., 2010; Gavrieletal., 2011; Engel and Moran, 2013)。通过宏基因组微生物多样性分析发现，果蝇肠道中的核心菌群主要包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、醋杆菌科(Acetobacteraceae)和乳杆菌科(Lactobacillaceae)的细菌。如黑腹果蝇肠道中的植物乳杆菌Lactobacillusplantarum和醋酸菌Acetobactermalorum可增加黑腹果蝇Drosophilamelanogaster的产卵量、取食量以及体重(Qiaoetal., 2019)；斑翅果蝇肠道中的乳酸菌属Lactobacillus, 明串珠菌属Leuconostoc, 乳球菌属Lactococcus, 丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)可为斑翅果蝇提供生长发育所需要的关键蛋白质(Bingetal., 2018)。通过传统分离培养发现，斑翅果蝇肠道内比较稳定的细菌种类包括产酸克雷伯氏菌Klebsiellaoxytoca、弗氏柠檬酸杆菌Citrobacterfreundii、金黄杆菌属Chryseobacteriumsp.、形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillusfusiformis(高欢欢等, 2017)，其中产酸克雷伯氏菌和弗氏柠檬酸杆菌与斑翅果蝇的生长发育以及氨基酸、糖原等物质的代谢密切相关(高欢欢等, 2020)。

在长期进化的过程中，昆虫对有利于自身生长发育的肠道微生物产生了一定的趋向性，具体表现为取食和产卵等行为的变化。如，黑腹果蝇成虫和幼虫对添加肠道微生物的培养基具有更强烈的趋性(Qiaoetal., 2019)；桔小实蝇Bactroceradorsalis肠道细菌蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus、粪肠球菌Enterococcusfaecalis、阴沟肠杆菌Enterobactercloacae和弗氏柠檬酸杆菌均对桔小实蝇成虫具有吸引作用(Wangetal., 2013)；将产酸克雷伯氏菌与棕榈糖混合后作为食诱剂可吸引更多的瓜实蝇Bactroceracucurbitae和南瓜实蝇B.tau(Soodetal., 2010)。多项研究表明，肠道微生物之所以具有吸引寄主昆虫的作用，是因为其产生的挥发性代谢物质可以调控寄主昆虫的化学通讯(Sacchettietal., 2014)。例如，肠道微生物肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae和弗氏柠檬酸杆菌释放的3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇、苯酚和2,5-二甲基吡嗪等物质对墨西哥果蝇Anastrephaludens具有明显的吸引作用；变形杆菌属细菌Proteussp.释放的正丁醇和丁酮可吸引昆士兰实蝇Bactroceratryoni取食和产卵(Leroyetal., 2011)。

对寄主昆虫具有引诱作用的肠道微生物可用于害虫的防治(Soodetal., 2010)，但目前斑翅果蝇肠道中的微生物对其是否具有吸引作用以及何种挥发性物质发挥作用均未有相关报道。因此，本研究以斑翅果蝇的肠道细菌产酸克雷伯氏菌作为研究对象，通过对斑翅果蝇成虫的趋性研究以及菌液中挥发性物质的检测，寻找对斑翅果蝇成虫具有吸引作用的化学物质，为斑翅果蝇的防治提供重要的指导。

1 材料与方法

1.1 斑翅果蝇和产酸克雷伯氏菌菌株

斑翅果蝇来源于山东省农业科学院植物保护研究所的实验室种群，该种群饲养于温度25±0.5℃、相对湿度70%±0.5%、光周期16L∶8D的人工气候室中。饲喂以香蕉、苹果、玉米粉、蔗糖、酵母、防腐剂为主要成分的人工饲料，此为正常饲养的斑翅果蝇品系。产酸克雷伯氏菌菌株为山东省葡萄研究院自存的菌株。

1.2 产酸克雷伯氏菌对斑翅果蝇成虫的引诱实验

将产酸克雷伯氏菌划线活化后，挑取单菌落置于装有100 mL NB培养液的250 mL的三角瓶中25℃摇菌72 h，使菌体进行充分的生长和代谢。取80 mL菌悬液5 000 r/min离心10 min，经0.45 μm过滤器过滤，其上清液用于诱集斑翅果蝇成虫；以无菌的NB培养基上清液为对照。

将1 mL产酸克雷伯氏菌上清液和NB培养基的上清液分别滴在双层滤纸纸盘上(直径为9 cm)，放置于长×宽×高=45 cm×45 cm×45 cm笼子的两个对角处。将200头斑翅果蝇成虫饥饿12 h后释放至笼子中心，雌雄比例为1∶1，10 min后记录滤纸上引诱的斑翅果蝇的成虫数量及雌雄比例，重复3次，此为无寄主植物时的选择性试验。另吸取1 mL产酸克雷伯氏菌上清液和培养基上清液分别滴在放置有半个巨峰葡萄的塑料培养皿(直径为3.5 cm)中，方法同上，此为有寄主植物作为介质时的选择性试验。

1.3 产酸克雷伯氏菌挥发性物质的GC-MS测定

将产酸克雷伯氏菌划线活化后，挑取单菌落置于装有100 mL NB培养液的250 mL的三角瓶中25℃摇菌72 h，取菌悬液5 000 r/min离心10 min，经0.45 μm过滤器过滤，得到上清液后利用气相色谱-质谱联用仪GCMS-2010 ULTRA及工作站(Shimadzu 公司，日本)进行固相微萃取实验，以NB培养基的上清液为对照。取8 mL产酸克雷伯氏菌上清液放置于15.0 mL样品瓶中，加入磁力搅拌子、2.0 g氯化钠和1 μL浓度为2.01 mg/L 99.99%的2-辛醇(Sigma，美国)作为内标，用带聚四氟乙烯胶垫的瓶盖封闭，启动磁力搅拌器(PC-420D型，Supelco公司，美国)，设定转速为850 r/min，在30℃下平衡10 min，通过隔垫插入萃取头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS, Supelco 公司，美国)，萃取30 min，插入GC-MS进样口解吸10 min，进行GC-MS分析，重复5次。

GC条件：高纯氦气，不分流进样，进样口温度250℃，柱温采用程序升温：起始柱温40℃，以5℃/min升至170℃，保持3 min，以8℃/min升温至230℃，保持4.5 min，恒流模式，流量: 1.8 mL/min。MS条件：色谱-质谱接口温度：250℃，离子源温度：200℃，电离模式：电子轰击源(EI)，轰击能量：70 eV，全扫描模式，质量数范围m/z 30～500。

通过质谱谱库检索与NIST 11和NIST 11S质谱库的标准质谱图比对定性，匹配度大于80%的物质作为化合物定性结果，采用半定量方法对各组分进行定量分析(陶永胜等, 2008)。

1.4 产酸克雷伯氏菌主要挥发性物质对果蝇的趋性检验

选择1.3节鉴定到的4种含量较高的产酸克雷伯氏菌挥发性物质用于斑翅果蝇的趋性实验。用Y型嗅觉仪(主臂15 cm，侧臂10 cm，内经2 cm，两侧臂间夹角30°)对斑翅果蝇趋性反应进行观察。两侧臂端分别接200 mL广口瓶，分别用特氟龙软管连接大气采样仪，进行送气处理。光强度：1 500 lx;流速：200 L/min;温度: 24±1℃；相对湿度：60%～70%(刘燕等, 2018)。吸取10 μL挥发性物质滴于圆形滤纸片(直径1.5 cm)上，置入Y型嗅觉仪其中一个侧臂广口瓶内，另一侧臂广口瓶内以水滴于圆形滤纸片作为对照，将20头斑翅果蝇成虫(雌雄比为1∶1)置于主臂端，在侧臂端进行送气(100 mL/min)，30 min后统计两侧臂成虫数量。重复10次。

1.5 数据分析

产酸克雷伯氏菌上清液和NB培养基上清液对斑翅果蝇的诱集比例按如下公式进行计算：

诱集比例(%)=

本研究中所得的数据均采用T检验分析，显著水平为0.05。数据分析所用的软件为SPSS20.0。

2 结果

2.1 产酸克雷伯菌对斑翅果蝇成虫的引诱作用

无论寄主是否存在，产酸克雷伯氏菌上清液对斑翅果蝇成虫的诱集比例均显著高于NB培养基上清液的(图1)。无寄主植物条件下，产酸克雷伯氏菌对斑翅果蝇成虫的诱集比例是NB培养基的5.11倍(产酸克雷伯氏菌上清液: 51.75%±6.22%; NB培养基上清液: 10.13%±0.03%)(T=-6.699,P=0.02)。有寄主作为介质时，产酸克雷伯氏菌上清液对斑翅果蝇成虫的诱集比例是35.78%±4.05%，显著高于NB培养基上清液的(13.78%±0.77%)(T=-4.893,P=0.04)，但与无寄主植物条件下相比差距有所减少。

图1 产酸克雷伯氏菌上清液对斑翅果蝇成虫的引诱效果Fig. 1 Attractiveness of Klebsiella oxytoca supernatant to Drosophila suzukii adultsCK: NB培养基Nutritional broth medium. 本实验使用的寄主植物为半个巨峰葡萄。图中数据为平均值±标准误；柱上星号表示产酸克雷伯氏菌上清液的引诱比例与NB培养基的比较差异显著(P<0.05, T检验)。Half Kyoho grape was used as the host plant in this experiment. Data in this figure are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference in the attractive proportion between K. oxytoca supernatant and nutritional broth (NB) medium (P<0.05, T-test).

2.2 产酸克雷伯菌上清液对不同性别斑翅果蝇成虫的引诱作用

由图2可知，无论寄主植物是否存在，产酸克雷伯菌对斑翅果蝇雌雄成虫的影响不同。无寄主植物的条件下，产酸克雷伯氏菌上清液引诱到的斑翅果蝇雄虫的数量为58.00±4.19头，显著高于引诱到的雌虫的数量(37.33±4.67)(T=1.57,P=0.044)，而NB培养基引诱到的斑翅果蝇雌虫和雄虫数量并没有显著差异(P>0.05)(图2: A)。有寄主植物的条件下，NB培养基和产酸克雷伯氏菌上清液对斑翅果蝇雄虫和雌虫的引诱均没有显著差异(P>0.05)(图2: B)。

图2 产酸克雷伯菌上清液对不同性别斑翅果蝇雌雄成虫的引诱作用Fig. 2 Attractiveness of Klebsiella oxytoca supernatant to female and male adults of Drosophila suzukiiA: 无寄主植物Without host plant; B: 有寄主植物With host plant. 1: NB培养基(对照)Nutritional broth medium (control); 2: 产酸克雷伯氏菌上清液 K. oxytoca supernatant. 图中数据为平均值±标准误；柱上星号表示同一处理诱集到的雌雄成虫数量之间的差异显著(P<0.05, T检验)。Data in the figure are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference between the number of female and male adults attracted by the same treatment (P<0.05, T-test).

2.3 产酸克雷伯氏菌挥发性物质对斑翅果蝇的引诱作用

产酸克雷伯氏菌上清液中检测到21种挥发性物质(表1)。在对照NB培养基上清液中检测到12种与产酸克雷伯氏菌上清液中相同的挥发性物质，其中吲哚、乙酸异戊酯、乙醇、2,4-二叔丁基苯酚、苯甲醛、甲氧基苯肟、乙酸、1-辛醇、1-己醇和苯酚等10种挥发性物质的浓度均显著低于产酸克雷伯氏菌上清液中的浓度，另外2种挥发性物质2,5-二甲基吡嗪和2,4-二甲基苯甲醛的浓度在产酸克雷伯氏上清液和对照NB培养基上清液中差异不显著，但浓度均较低(表1)。而在产酸克雷伯氏菌上清液特有的挥发性物质中，浓度较高的为3-甲基-1-丁醇和2-苯乙醇。因此，选择3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇以及与培养基中的浓度差异较为显著的吲哚和乙酸异戊酯这4种物质作为产酸克雷伯氏菌上清液的主要挥发性物质，用于检验对斑翅果蝇的趋性。

表1 产酸克雷伯氏菌上清液和NB培养基上清液中的挥发性物质含量Table 1 The contents of volatile substances in the supernatant of Klebsiella oxytoca and NB medium

斑翅果蝇对4种产酸克雷伯氏菌挥发性物质中的3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇和吲哚均有一定的趋向性，其中吲哚引诱到的斑翅果蝇比例最高，为50.00%±12.25%(T=3.06,P=0.02)，3-甲基-1-丁醇和2-苯乙醇引诱到的斑翅果蝇分别为总数的28.33%±4.77%和23.33%±6.67%，均显著高于水引诱的(3-甲基-1-丁醇:T=-3.15,P=0.01; 2-苯乙醇:T=2.28,P=0.04)。乙酸异戊酯对斑翅果蝇则具有驱避作用，引诱到斑翅果蝇的比例为21.11%±3.09%，而35.71%±6.12%的斑翅果蝇选择了水端口(图3: A)。3-甲基-1-丁醇吸引到的雄虫数量是吸引到雌虫数量的2.4倍，2-苯乙醇、吲哚和乙酸异戊酯对斑翅果蝇雌雄虫的引诱作用没有明显的差别，雌雄虫比例均在50%左右(图3: B)。

图3 产酸克雷伯氏菌4种挥发性物质对斑翅果蝇成虫的引诱作用(A)和被引诱成虫的雌雄比例(B)Fig. 3 Attractiveness (A) of four volatile substances of Klebsiella oxytoca to Dlebsiella suzukii adults and the proportions of female and male adults attracted (B)1: 3-甲基-1-丁醇3-Methyl-1-butyl alcohol; 2: 2-苯乙醇2-Phenethyl alcohol; 3: 乙酸异戊酯Isoamyl acetate; 4: 吲哚Indole. 图中数据为平均值±标准误；柱上星号表示挥发性物质处理组与水处理组(对照)之间差异显著(P<0.05, T检验)。Data in the figure are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference between the volatile substance treatment group and the water treatment group (control)(P<0.05, T-test).

3 讨论

本研究以斑翅果蝇的优势肠道细菌产酸克雷伯氏菌为研究对象，证明此菌对斑翅果蝇的成虫具有吸引作用。产酸克雷伯氏菌在瓜实蝇、葱地种蝇Deliaantiqua、桔小实蝇等其他昆虫的肠道中均属于丰富度相对较高的菌种，且对寄主昆虫具有吸引作用(Damodarametal., 2016; Hadapadetal., 2016; Guoetal., 2017)，这与本研究的结果一致。肠道微生物在代谢过程中可释放特定的挥发性物质，从而对昆虫具有吸引作用。在瓜实蝇肠道细菌肺炎克雷伯氏菌上清液中检测到的3-甲基-1-丁醇和2-苯乙醇可吸引瓜实蝇雌虫完成交配行为，肠道细菌肠杆菌Enterobacteragglomerans和弗氏柠檬酸杆菌中检测到了具有吸引作用的3-甲基-1-丁醇(Hadapadetal., 2016)。本研究中，斑翅果蝇肠道中产酸克雷伯氏菌上清液中也检测到3-甲基-1-丁醇和2-苯乙醇，并且已证明对斑翅果蝇成虫具有引诱作用(图3)。与已报道的研究结果不同的是，产酸克雷伯氏菌挥发性物质中对斑翅果蝇具有吸引作用的还有吲哚，而乙酸异戊酯对斑翅果蝇则具有驱避作用(图3)。由此说明，产酸克雷伯氏菌对斑翅果蝇的吸引作用与3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇、吲哚密切相关，而本研究中3-甲基-1-丁醇可引诱更多的斑翅果蝇的雄虫，这可能是产酸克雷伯氏菌能吸引更多雄虫的原因。

同时，本研究也分析了寄主植物对斑翅果蝇吸引作用的影响，无寄主植物的条件下，产酸克雷伯氏菌对雄成虫的吸引作用强于对雌成虫的(图2)，而有寄主植物干扰的条件下，微生物对性别的影响并未有明显差异(图2)。这可能是因为寄主植物中含有的可挥发性物质会干扰斑翅果蝇对气味的识别，寄主植物中的乙酸异戊酯可吸引斑翅果蝇产卵取食(Revadietal., 2015)，而本研究中产酸克雷伯氏菌的挥发性物质乙酸异戊酯对斑翅果蝇则具有驱避作用(图3)。另外，果蝇的行为还可被寄主植物中的其他多种化合物影响。例如，果蝇Drosophilasechellia对桑葚中的正己酸具有强烈的趋向性，黑腹果蝇、拟果蝇D.simulans和伊米果蝇D.immigrans均对水果中的发酵化合物以及浓度较高的乙醇具有趋向性(Ibbaetal., 2010)。寄主水果蓝莓、草莓、樱桃等水果中的挥发性物质己醛、2-庚酮、反式-2-己烯醛和芳樟醇可以影响斑翅果蝇雌虫的定向和产卵行为(刘燕等, 2018; 蔡普默等, 2019)。因此，斑翅果蝇肠道微生物的挥发性物质与寄主挥发物之间是否存在互作，两者会产生协同作用还是拮抗作用需要进一步的研究。

已有研究证明，对昆虫具有吸引作用的微生物可以作为诱剂用于寄主昆虫的防治(Soodetal., 2010)。但目前用于诱杀斑翅果蝇的方法中主要集中于利用酵母、糖水、醋、酒精等的混合物的物理诱杀(Iglesiasetal., 2014; 王云鹏等, 2018; 马茜, 2019)，并没有利用肠道微生物及其挥发性物质进行诱杀的报道。因此，本研究的结果为斑翅果蝇的防治提供了新的诱剂，而斑翅果蝇的肠道微生物产酸克雷伯氏菌或者挥发性物质3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇和吲哚作为诱剂时，对斑翅果蝇的防治效果需要继续进行研究和验证。此项研究将为降低斑翅果蝇的为害率、提高果实品质提供新的方法。