转基因杨树林下种植转基因棉花对转基因杨棉复合系统内节肢动物群落多样性的影响

沈文静, 刘来盘, 方志翔, 张 莉, 刘 标

(生态环境部南京环境科学研究所, 南京 210042)

杨树是我国重要的栽培树种，在我国分布广泛且大规模种植，由于人工林品种单一，虫害十分严重(张星耀等, 2012)。为了有效防治虫害，减少农药的使用，我国早在20世纪80年代末就开展来源苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis的杀虫基因(Bt基因)在杨树中应用相关研究。2002年，转cry1Ac基因欧洲黑杨Populusnigra和转cry1Ac+API基因741杨获得原国家林业局良种审定和商品化许可，使得我国成为转基因林木树种应用最早的国家(丁莉萍等, 2016)。据农业部转基因生物安全管理办公室统计，截止2011年，我国已推广转Bt基因杨树450 hm2，2018年转基因杨树研发和应用被纳入“转基因生物新品种培育”国家科技重大专项实施，转Bt基因杨树的推广使用面积进一步扩大。

转Bt基因棉花Gossypiumhirsutum是我国使用最早、种植面积最大的转基因作物，2015年我国转Bt基因棉花种植面积达370万公顷，占全部棉花面积的97%(James, 2016)。转基因棉花长期种植对棉田节肢动物群落多样性的影响已有较多研究，雒珺瑜连续5年调查转Bt棉田中节肢动物多样性变化发现，相比非转基因棉花，转Bt棉田中节肢动物昆虫群落、害虫亚群落和天敌亚群落结构等均无显著差异(雒珺瑜, 2016)。Liu和Luo(2019)报道转基因棉田临近植物的多样性与棉田叶片危害程度呈负相关关系，说明临近植物对棉田生物多样性产生影响。转Bt基因杨树大面积推广后，转基因杨树和转基因棉花不可避免相遇，形成转基因杨棉复合生态系统。目前已有转基因杨树和转基因棉花复合系统对生物多样性影响相关报道，陈辉惶等(2012)报道转基因杨棉复合系统对靶标类害虫有极强的抑制作用，但系统内节肢动物均匀度和生物多样性降低；姜文虎等(2018)研究表明转基因杨棉复合系统对节肢动物群落没有负面效应。上述研究主要基于树龄大于6年的成年杨树，而林下种植的转基因杨树和转基因棉花在空间上更接近，对生物多样性和靶标害虫长期影响有待研究。本研究构建了杨树幼林下套种转基因棉花的复合系统，调查了杨树和棉花地上部节肢动物种类和数量，分析了转基因杨树林下种植对转基因棉花节肢动物群落多样性影响，监测不同时期转基因杨树和转基因棉花外源Bt蛋白表达水平，研究结果能够为转基因杨棉复合系统安全使用提供数据。

1 材料与方法

1.1 供试植物

杨树品种为转cry1Ac基因欧洲黑杨P.nigra世纪杨，非转基因杨树为107杨，杨树植株均由中国林业科学研究院林业研究所提供；棉花G.hirsutum品种为转基因抗虫棉花冀H239。

1.2 试验地点与小区设置

试验地位于河北省任丘市马汉镇，试验地为平坦农地，土质一致。抗虫转基因欧洲黑杨和非转基因杨树107杨均为2019年4月新栽植，移栽时树龄1年，本研究设置转基因杨树与转基因棉花(复合生态系统1)和非转基因杨树与转基因棉花(复合生态系统2)两种杨棉复合系统，每复合系统设置3个重复小区。每个小区625 m2(25 m×25 m)，杨树株行距3 m×3 m，杨树林下种植转基因棉花冀H239(株行距0.5 m×0.5 m)。棉花种植时间为2019年5月，除不施用农药外，棉田采取常规管理模式。考虑到种植现状，本研究未设置非转基因棉花小区。

1.3 调查方法

种植后每隔约15 d采用直接观察法调查杨树和棉花地上部植株节肢动物种类和个体数量，小区采用S型取样法在林中随机确定3个调查点，每点调查10株杨树和棉花，记录植株上所有节肢动物的种类及个体数量。对田间不能辨别的种类编号保存，带回实验室鉴定。

1.4 叶片Bt蛋白测定

每月采集一次杨树和棉花新鲜叶片，均为枝条倒数第3叶，低温保存，外源Bt蛋白含量利用Envirologix公司Cry1Ab/c 蛋白ELISA试剂盒(AP003)测定，具体测定按照试剂盒说明书进行。

1.5 数据分析

统计各调查日期节肢动物种类与个体数量，计算群落香农指数(Shannon-Wiener指数H=-∑PilnPi)、优势集中性指数[C=∑(Ni/N)2]、均匀度指数(Pielou指数J=H/lnS)，其中，S为物种数，Pi=Ni/N，Ni为第i个物种的个体数，N为总个体数(Krebs, 1999)。

使用Excel2016和SPSS18软件中方差分析法对试验数据进行统计，显著性水平均设为0.05。

2 结果

2.1 杨棉复合系统中地上节肢动物主要类群

2019年4-10月间共调查10次，2个杨棉复合系统中共发现地上部节肢动物60种，分属10目42科(表1)。60种节肢动物中复合生态系统1(转基因杨树和棉花)与复合生态系统2(非转基因杨树和棉花)相同物种41种。将复合生态系统1和复合生态系统2中节肢动物按照调查所在植物进行分组，共计有13种在2个系统中4种调查植物均有发现。两种复合生态系统中转基因棉花植株上相同物种共计有25种，主要物种白粉虱Trialeurodesvaporariorum、大青叶蝉Cicadellaviridis、红蜘蛛Tetranychuscinnbarinus、瓢虫类、蜘蛛类、盲蝽类等，这些物种在棉花上的多度均大于1%，为转基因棉花上常见物种或优势物种。转基因杨树和非转基因杨树上相同物种共计有20种，主要物种为鳞翅目毒蛾类、叶蝉类、叶甲类、瓢虫类等。复合生态系统1转基因杨树和棉花上相同物种共计有18种，复合生态系统2中非转基因杨树和棉花杨树上相同物种共计有14种。

表1 转基因或非转基因杨树与转基因棉花复合系统中地上节肢动物群落的目和科组成Table 1 The order and family composition of the above-ground arthropod community in transgenic ornon-transgenic poplar-transgenic cotton composite systems

2.2 不同杨棉复合生态系统对节肢动物群落组成和个体数量的影响

为具体分析转基因杨树种植对复合系统内地上节肢动物类群的影响，将节肢动物分为害虫、捕食性天敌、寄生性天敌和中性昆虫4种功能群，统计整个调查期各功能群内代表性节肢动物累计个体数量(表2)。2种复合系统中，转基因棉花植株地上节肢动物各类群累计个体数量相当，除鳞翅类害虫外，各类群累计个体数量均无显著性差异(P>0.05)。转基因杨树上的鳞翅目害虫、寄生蜂类累计个体数量显著小于非转基因杨树上的(P<0.05)，而叶甲类、植食性蝽累计个体数量显著高于非转基因杨树上的(P<0.05)，其他9个类群累计个体数量在两种杨树上无显著性差异(P>0.05)。虽然转基因杨树上的植食性蝽类个体数量高于非转基因杨树上的，因其个体数量少，可能是调查误差导致。相比非转基因杨树，转基因杨树上鳞翅目害虫的显著减少主要是Bt蛋白控制靶标害虫美国白蛾Hyphantriacunea、杨黄卷叶螟Botyodesdiniasalis等鳞翅目害虫。虽然2个复合系统中棉花上鳞翅类害虫个体数量均较少，但复合生态系统1中棉花上的鳞翅类昆虫个复合生态系统1 Composite system 1: 转基因杨树-转基因棉花Transgenic poplar-transgenic cotton; 复合生态系统2 Composite system 2: 非转基因杨树-转基因棉花Non-transgenic poplar-transgenic cotton. 下同The same below. 表中数据为平均值±标准差; 同行数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05, Duncan氏复极差检验)。Data in the table are mean±SD. Different small letters following the data in the same row meant significant difference (P<0.05, Duncan’s multiple range test).

表2 转基因或非转基因杨树与转基因棉花复合系统中地上节肢动物各主要功能群累计个体数量(头/100株)Table 2 The accumulated numbers of individuals of the main functional groups of above-ground arthropodsin transgenic or non-transgenic poplar-transgenic cotton composite systems (individuals per 100 plants)

体数量显著少于复合系统2中棉花上个体数量(P<0.05)。转基因杨树不仅显著降低自身鳞翅类害虫个体数量，还对同一系统中棉花上鳞翅目昆虫个体数量有协同控制作用。相比非转基因杨树-棉花系统，转基因杨树种植未对同系统中转基因棉花地上节肢动物各功能群个体数量产生明显影响。

2.3 不同杨棉复合系统节肢动物群落结构多样性变化

将各调查时期数据相加，从系统整体和物种(植物种类)两个层次研究转基因杨树种植对杨棉生态系统节肢动物群落结构多样性指数的影响(表3)。从生态系统整体层面，复合生态系统1和复合生态系统2中节肢动物群落在香农指数、均匀度指数和优势集中性指数均无显著差异(P>0.05)。将棉花地上节肢动物数据进行分析，发现2种复合生态系统中转基因棉花上上述3种指数也无显著性差异(P>0.05)，这一结果和节肢动物各类群累计个体数量是一致的。转基因杨树上节肢动物香农指数显著高于非转基因杨树上的(P<0.05)，优势集中性指数显著低于非转基因杨树上的(P<0.05)。不管是转基因杨树还是非转基因杨树，其节肢动物香农指数均显著高于各自对应复合系统中棉花上的(P<0.05)。

表3 调查期间转基因或非转基因杨树与转基因棉花复合系统中节肢动物群落多样性指数Table 3 The diversity indexes of arthropod communities in transgenic or non-transgenicpoplar-transgenic cotton composite systems during the whole investigation period

按照调查日期分别计算2个复合系统中的转基因棉花地上节肢动物多样性指数(图1: A)，2个复合系统中棉花上节肢动物香农指数在各调查期呈现相同波动趋势，在7月底到8月中旬，由于棉田暴发白粉虱和蚜虫，使得2个复合系统中转基因棉花上节肢动物的香农指数均断崖式下降，随着白粉虱暴发结束，香农指数再次上升，10月棉花进入生育后期，叶片衰老凋落，植株上节肢动物种类和个体数量变少，香农指数相应降低。10次调查中，2个复合系统中的转基因棉花上节肢动物的香农指数仅8月17日有显著性差异(P<0.05)，其他时期均无显著性差异。2个复合系统中棉花地上节肢动物群落均匀度指数变化趋势与香农指数变化趋势一致，在7月底白粉虱暴发后，8月和9月两次调查中复合生态系统2中棉花上节肢动物均匀度指数值高于复合生态系统1中棉花上节肢动物的均匀度指数值，但无显著差异。复合生态系统1和复合生态系统2中棉花上节肢动物优势集中性指数变化趋势一致，数值上也无显著差异。2个复合系统中的转基因棉花上节肢动物的优势集中性指数出现两次上升，原因与导致香农指数变化的因素一致。群落的稳定性是指群落在一段时间过程中维持物种间相互组合及各物种个体数量关系的能力，以及在受到扰动的情况下恢复到原来平衡状态的能力。在7月底白粉虱暴发造成棉株上节肢动物群落香农指数和均匀度降低， 随着暴发期过去，不管复合生态系统1还是复合生态系统2相关群落结构指数均能够大致恢复到暴发前水平，这表明两种系统中棉花节肢动物群落保存了相对稳定，也说明相比非转基因杨树，转基因杨树的种植未对棉花地上节肢动物群落稳定造成明显影响。

图1 转基因或非转基因杨树与转基因棉花复合系统中棉花(A, C和E)和杨树(B, D和F)地上节肢动物群落多样性指数动态变化Fig. 1 Dynamics of diversity indexes of the above-ground arthropod communities on cotton (A, C, and E) and poplar (B, D, and F) plants in transgenic or non-transgenic poplar-transgenic cotton composite systems

从系统整体看，转基因杨树地上节肢动物香农指数显著高于非转基因杨树上的(表3)。每次调查单独计算群落多样性指数发现转基因杨树地上节肢动物香农指数在大部分调查期均高于非转基因杨树上的，6月5日、6月21日和9月7日的香农指数值显著高于非转基因杨树上的(P<0.05)，鳞翅目害虫个体数量是转基因杨树和非转基因杨树地上节肢动物群落功能群个体数量最主要差异所在，6月5日和6月21日非转基因杨树上美国白蛾、卷叶螟个体数量均远超转基因杨树上的，引起这两个时期非转基因杨树上节肢动物香农指数下降(图1: B)。7月31日棉田暴发了白粉虱，虽然主要是发生在棉株上，但因害虫自主迁飞、风力等因素，转基因杨树和非转基因杨树上均发现一定数量的白粉虱，虽然远小于棉株上的数量，但基数大，仍然造成转基因杨树和非转基因杨树上节肢动物香农指数和均匀度指数降低，优势集中性指数上升。和棉花不同的是，在调查后期，转基因杨树和非转基因杨树上节肢动物香农指数下降的程度有限，在10月17日调查中，复合生态系统1中转基因杨树上发现13个物种，而棉花上只有4个物种，复合生态系统2也是这一情况。10月中旬棉花已经进入收获期，叶片开始枯黄，而杨树还正常生长，枝叶茂盛，这可能造成了系统中地上节肢动物向杨树聚集。

2.4 Bt蛋白在转基因杨树和棉花叶片中含量变化

转Bt基因植物抗虫性主要通过其表达的Bt蛋白来实现，利用ELISA方法每月监测转基因杨树和棉花叶片中外源Bt的表达量(表4)。转基因棉花叶片外源Bt蛋白含量5月21日(苗期)最高，达到1 026.26±89.35 ng/g FW，而后随着生育期的延长而逐渐下降，10月17日(收获期)最低(293.33±68.73 ng/g FW)。 转基因杨树叶片Bt蛋白含量变化幅度远小于棉花叶片的，7月18日杨树叶片Bt蛋白含量最高(121.56±17.04 ng/g FW)，其他5个时期变化范围在76.28～96.39 ng/g FW间，且在这5个调查时期均无显著差异(P>0.05)。每月监测数据均表明转基因杨树叶片中外源Bt蛋白含量显著低于转基因棉花叶片中的。

3 讨论

随着我国转基因植物研发和利用不断推进，目前转Bt基因棉花、玉米、水稻和杨树在我国均获得安全生产证书。和其他国家大面积单一作物种植模式不同，我国碎片化的土地承包制度和间作套种耕作模式使得不同外源基因不同类型的转基因植物共处在同一田地中，转基因杨树和转基因棉花复合种植就是一种常用的种植模式。转基因杨棉复合种植模式下对生物多样性和病虫害发展等影响已有相关研究，Zhang(2015a, 2015b)在河北利用已栽种6年的转cry1Ac基因741白杨和非转基因杨树设置4个不同杨树-棉花生态系统组合，研究转cry1Ac基因741白杨对系统内害虫和节肢动物多样性影响；陈辉惶等(2012)在新疆利用已栽种7年的转cry1Ac基因欧洲黑杨和非转基因杨树，设置类似系统研究节肢动物群落变化。上述两位学者利用树龄较大的杨树设置小区，可能因郁闭，棉花小区未设置在林下，而是紧靠杨树林，形成杨树-棉花隔离带复合系统。本研究考虑到我国北方退耕还林，幼林阶段林下复合种植的现实，种植1年生杨树，直接在林下种植棉花，杨树和棉花在同一空间，形成复杂关联的杨树-棉花林下复合系统。杨树-棉花隔离带系统和杨树-棉花林下系统在我国都广泛存在，甚至间杂在一起，这两种系统的调查数据可互相补充和参考。

单一杨树种植模式下，转Bt基因杨树对节肢动物群落生物多样性影响结论相对一致，一般认为转Bt基因杨树对靶标害虫和非靶标植食性害虫均存在负效应,而对天敌和中性节肢动物的组成和发生均具有正效应(高素红等, 2006; 胡建军等, 2010; Zuoetal., 2018)。转基因杨棉复合系统对节肢动物多样性影响还不确切，陈辉惶等(2012)报道中对靶标类害虫有较强的复合抑制效果，但是会造成其他非靶标害虫种类和个体数量增加，并有上升为主要害虫的趋势，并引致天敌的增殖；姜文虎等(2018)报道转基因杨棉复合系统对靶标害虫具有较好的毒杀以及控制种群个体数量的作用，对系统中非目标昆虫以及天敌和中性昆虫作用不明显。本研究中的复合生态系统1和复合生态系统2群落总体结构无大区别，但转基因杨树上叶甲类累计个体数量高于非转基因杨树上的，而寄生蜂类群的个体数量则低于非转基因杨树上的(表2)，转基因杨树上鳞翅目害虫减少所留下的空生态位填补问题还需进一步监测。单一转基因植物对群落结构和生物多样性影响结论不能够简单推广到多类型转基因植物共存的复合生态系统中。

Zhang等(2015b)将棉花和杨树调查数据整合一个总体分析，认为转基因杨棉生态系统对害虫有较强的抑制作用，对群落结构没有影响，群落多样性指数表明转基因棉花和转基因杨树组合要好于其他组合。陈辉惶等(2012)报道非转基因杨树林中优势节肢动物类群复杂，转基因杨棉系统使均匀度和生物多样性降低。本研究中复合生态系统1和复合生态系统2总体群落结构指数均无显著差异，转基因杨树和非转基因杨树地上节肢动物的香农指数(Shannon-Wienner指数)均较高，而2个复合系统中转基因棉花上节肢动物香农指数相对较低(表3)，将杨树和棉花的调查数据整合，计算获得整个复合系统的节肢动物香农指数却更接近转基因棉花上的，这是因为2019年7-8月间棉花上白粉虱和蚜虫大暴发，种群个体数量巨大，极大降低了整个系统生物多样性。当研究复杂生态系统中节肢动物多样性时，由于植物物种丰富多样，生态系统中节肢动物群落结构和功能稳定，生物多样性特征指数在生态系统总体层面有指示意义。但对于只有2～3种植物存在简单复合生态中，由于不同植物自身特性和空间布局差异，各类植物所栖息和吸引的节肢动物种类的个体数量差异巨大，尤其是某一特定时期暴发的种群个体数量庞大的害虫，生态系统层面生物多样性特征指数不能够反映真实情况，因此有必要按照研究目的将复合系统拆解分析。

Bt蛋白含量是转基因植物控制害虫的物质基础，Bt蛋白含量稳定大量表达是生产应用所必需的。Sachs等(1998)认为外源Bt蛋白表达量受植物类型、基因类型、基因插入位点、种植环境、启动子等多方面影响。大量研究表明转Bt基因棉花叶片Bt蛋白含量随生长发育推进而降低(张永军等, 2001; 沈平等, 2010)，本研究结果(表4)也证实了这一点。牛小云等(2011)报道转cry3A基因741白杨树叶片毒蛋白含量随生长期无规律变化，张益文(2012)报道转cry1Ac基因741杨树长短枝叶片均随生长时期先上升后下降，本研究中采用转基因杨树为转cry1Ac基因欧洲黑杨，其外源蛋白表达量总体保持稳定。张超等(2019)报道转多Bt基因欧洲黑杨中叶片Cry3A蛋白含量极显著高于Cry1Ac蛋白，张益文等(2015)报道转cry1Ac基因欧洲黑杨Bt蛋白在不同株系间表达量差异较大，可见转基因杨树叶片Bt蛋白表达量和生育期变化趋势因Bt基因类型和杨树种类不同而有较大差异。

Zhang等(2015a)和本研究均发现转基因棉花-转基因杨树复合系统中杨树植株上还有靶标害虫(美国白蛾等)存活。由于本研究采用林下种植方式，棉花衰老先于杨树，系统内包括鳞翅目害虫在内的昆虫在10月份向杨树聚集。本研究发现转基因杨树叶片Bt含量远远低于转基因棉花叶片的(表4)，张益文(2012)报道转基因杨树棉花复合系统中转cry1Ac基因741杨树叶片Bt蛋白含量也低于棉花叶片的。靶标害虫对Bt蛋白抗性是转基因植物应用后面临的最棘手问题，McGaughey和Whalon(1992)提出转Bt基因植物害虫抗性风险管理4项措施，其中高剂量庇护所是Bt植物应用后延缓抗性发展的主要措施。Jin等(2015)报道玉米、花生以及大豆等非棉花寄主作物充当自然庇护所延缓了我国黄河流域和长江流域棉铃虫对Cry1Ac抗性的演化，但延缓效率低于非Bt棉花。Wan等(2017)研究表明Bt棉花和非Bt棉花混合种植可以有效控制红铃虫对Bt棉花的抗性发展。庇护所策略只有当转基因作物能够持续表达足够高的Bt蛋白而导致全部或大部分敏感和抗性害虫死亡时才能发挥作用(Tabashniketal., 2013)。转基因棉花-转基因杨树两种植物外源Bt蛋白表达量差异大，且存在包括靶标昆虫在内的昆虫向转基因杨树迁移可能，因此需对复合系统下美国白蛾等靶标生物的抗性发展持续监测。

本研究结果表明，转基因杨树的引入未对转基因棉花地上部节肢动物群落结构和多样性指数产生显著影响，转基因杨树能够协同控制棉花上鳞翅目害虫个体数量；相比对照杨树，转基因杨树不仅显著控制了鳞翅目昆虫个体数量，其地上部节肢动物生物香农指数有所提高。转基因杨树为多年生植物，无法在短时间内通过改变种植方式、增加或者改变外源蛋白种类等方法延缓抗性发展，因此密切监测靶标生物的抗性发展是转基因杨树长时间广范围使用的安全保证。