内共生菌Cardinium对烟粉虱MED隐种耐药性的影响

曹 婷, 原梦颖, 杨 坤, 郭 磊, 褚 栋

(青岛农业大学植物医学学院, 山东省植物病虫害综合防控重点实验室, 山东青岛 266109)

昆虫内共生菌是存活于宿主昆虫体内的一类微生物，可分为初生内共生菌和次生内共生菌(又分别称专性和兼性内共生菌)(Douglas, 2010)。初生内共生菌遵循严格的垂直传播(即母系遗传)的传播方式，而次生内共生菌则往往兼具种内或种间水平传播的传播方式(Moranetal., 2008)。内共生菌可以通过多种方式提升它们在宿主种群中的感染率；这些方式包括供给宿主必需的氨基酸、维生素等营养物质，调控宿主的生殖方式及协助宿主对抗杀虫剂、病原菌和寄生性天敌等(Hedgesetal., 2008; Akman Gündüz and Douglas, 2009; Hosokawaetal., 2010; Parkeretal., 2013; Maetal., 2014; Kapantaidakietal., 2015)。近年来，研究发现某些次生内共生菌能影响宿主对杀虫剂的耐药性(Lietal., 2018)，而且对耐药性的影响与宿主遗传背景相关(Lietal., 2021)。例如，研究发现Wolbachia在某些遗传背景下与灰飞虱Ladellphaxstriatellus对常用杀虫剂噻嗪酮的抗性增加有关，而在其他背景下不起作用(Lietal., 2021)。

烟粉虱Bemisiatabaci是世界性重要的农业害虫之一，该虫被认为是含有至少44个隐种的复合体(Kanakala and Ghanim, 2019)。烟粉虱通过直接取食和传播多种植物病毒，给蔬菜、棉花、花卉等作物造成了巨大的经济损失(De Barroetal., 2011; Guoetal., 2021)。烟粉虱的防治主要依靠于杀虫剂的化学防治，新烟碱类农药在许多国家被广泛用于控制这种害虫(Elbertetal., 2008)。目前，许多国家的烟粉虱已经对新烟碱类杀虫剂产生了抗药性(Luoetal., 2010; Zhengetal., 2017)。烟粉虱内共生菌包括初生内共生菌Portiera以及至少7种次生内共生菌，即Hamiltonella,Arsenophonus,Wolbachia,Cardinium,Rickettsia,Fritchea和Hemipteriphilus(Zchori-Fein and Brown, 2002; Nirgianakietal., 2003; Weeksetal., 2003; Everettetal., 2005; Gottliebetal., 2006; Bingetal., 2013)。研究发现次生内共生菌感染可影响烟粉虱对杀虫剂的敏感性，如Rickettsia感染可提高烟粉虱MEAM1对啶虫脒、噻虫嗪和螺甲螨酯等杀虫剂的敏感性，尤其使其对吡丙醚的耐药性下降15倍(Kontsedalovetal., 2008)。

内共生菌Cardinium最早于2001年被发现并在2004年被命名，它是继Wolbachia后第2个被发现可以调控寄主昆虫生殖的内共生菌(张开军等, 2010; 尹祥杰等, 2015)。研究发现，Cardinium能影响节肢动物宿主的生殖调控与适合度(庞淑婷等, 2010; Zhuetal., 2012; Zhaoetal., 2018)。在中国，2009年全国烟粉虱MED隐种种群Cardinium感染率为16.3%(Panetal., 2012)，山东省2006-2009年烟粉虱MED隐种各地种群Cardinium感染率为7.6%～17.3%(Chuetal., 2011)。然而，Cardinium对烟粉虱MED隐种对杀虫剂(尤其新烟碱类杀虫剂)耐药性的影响尚不清楚。该方面的研究对于揭示烟粉虱MED隐种的种群适应性及扩张机制具有重要参考价值。

为了明确Cardinium对烟粉虱MED隐种对新烟碱类杀虫剂耐药性的影响，本研究测定了陵水与寿光烟粉虱MED隐种种群Cardinium感染与未感染品系对新烟碱类杀虫剂噻虫嗪和吡虫啉的耐药性。研究结果表明Cardinium感染能影响烟粉虱MED隐种对噻虫嗪和吡虫啉的耐药性，且不同种群间存在差异。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

供试烟粉虱MED：陵水种群于2017年1月采自海南省陵水黎族自治县，寿光种群于2017年8月采自山东省寿光市，均长期以烟草Nicotianatabacum品种NC89为寄主在人工气候室(温度27±1℃，相对湿度60%±5%，光周期16L∶8D)中连续饲养超过20代。饲养方法参照Himler等(2011)，即在每个烟粉虱种群中，将采集的田间烟粉虱种群进行雌雄配对，分别建立单雌系。再将Cardinium未感染品系(C-品系)单雌系雄成虫与感染单雌系雌成虫进行6代杂交，获得具有与未感染单雌系相同遗传背景的Cardinium感染品系(C*+品系)。利用mtCOI分子鉴定方法(Chuetal., 2010)，确认实验所用的4个品系皆为烟粉虱MED隐种；每隔30 d 就随机挑选每个烟粉虱品系10头个体进行内共生菌Cardinium的检测，确保种群的纯度。

1.2 药品与试剂

本实验所采用的杀虫剂分别为噻虫嗪原药(诺华农化有限公司)和75%吡虫啉水分散粒剂(瑞士先正达作物保护有限公司)。本实验DNA提取所用试剂盒为TIANamp Micro DNA Kit(天根生化科技有限公司)；PCR所用试剂包括10×PCR Buffer, dNTP Mixture, rTaq(TaKaRa宝生物工程有限公司), 50×TAE电泳缓冲液和琼脂糖(北京索莱宝科技有限公司)；PCR引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.3 内共生菌检测

基于常规PCR技术，检测C*+与C-品系烟粉虱初羽化成虫内共生菌差异。从烟草上分别吸取陵水和寿光地区Cardinium感染与未感染品系各20头初羽化成虫，每个地区不同品系4个重复。利用液氮将供试昆虫速冻后，采用TIANamp Micro DNA Kit微量样品基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取。提取的DNA用于PCR扩增，确认烟粉虱体内内共生菌种类，扩增所用各个内共生菌的引物见表1。PCR反应体系(13 μL): 10×PCR Buffer 1.3 μL, dNTP 0.26 μL，上下游引物(100 μmol/L)各0.26 μL, rTaq 0.13 μL, DNA 2 μL，添加DEPC水至13 μL。PCR反应程序参考表1中的文献进行。对所获得的PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，并且通过凝胶成像仪进行观察。

1.4 烟粉虱不同品系耐药性测定

采用琼脂保湿浸叶法(郭磊等, 2018)，分别用二甲基亚砜配制噻虫嗪、吡虫啉高浓度母液, 再用含有0.05% Triton X-100的水溶液将母液稀释成针对不同种群处理的不同的5个浓度梯度(陵水种群: 70, 90, 110, 130和150 mg/L; 寿光种群: 100, 125, 150, 175和200 mg/L)(因陵水和寿光种群抗药性不一致，分别以各自种群C-品系成虫48 h处理的LC50作为中间浓度，上下各选两个浓度梯度，每个种群共5个浓度梯度进行实验)，并以含有0.05% Triton X-100水溶液作为对照，将烟草叶片在药液中浸泡10 s后晾干备用。从2个种群的Cardinium感染与未感染品系中随机吸取25～35头烟粉虱成虫放入100 mL平底离心管，离心管的一端放置琼脂及农药处理过的烟草叶片，另一端用白色纱网封口。将有烟草叶片的一端向上放置，在人工气候室静置1 h后, 检查并去除管内受伤和死亡个体，48 h后记录烟粉虱的存活数和死亡数。每种处理至少设3个重复实验。

1.5 数据分析

运用DPS7.05软件中专业统计-生物测定-计数型数据机值分析计算各处理死亡率和校正死亡率(Tang and Zhang, 2013)，求出毒力回归方程、LC50及其95%置信区间。利用SPSS17.0软件进行数据统计分析；采用Mann-WhitneyU检验进行显著性分析(Skaljacetal., 2018)，验证各地区烟粉虱Cardinium感染与未感染品系各指标是否存在显著性差异，设显著性水平为P<0.05。

2 结果

2.1 内共生菌检测结果

烟粉虱陵水种群Cardinium未感染品系均含有初生内共生菌Portiera及次生内共生菌Rickettsia和Hamiltonella，而Cardinium感染品系还含有Cardinium。 与陵水种群结果相似，寿光种群Cardinium未感染品系均含有初生内共生菌Portiera及次生内共生菌Rickettsia和Hamiltonella，而Cardinium感染品系还含有Cardinium(图1)。

图1 烟粉虱MED隐种海南陵水种群和山东寿光种群内共生菌检测结果Fig. 1 Detection of endosymbionts in Bemisia tabaci MED from Lingshui, Hainan and Shouguang, Shandong

2.2 Cardinium感染与未感染品系对噻虫嗪的耐药性比较

Cardinium感染对烟粉虱陵水与寿光种群对噻虫嗪的耐药性具有不同影响。各浓度噻虫嗪处理后烟粉虱陵水种群Cardinium感染品系成虫死亡率显著低于未感染品系(P<0.05)(图2: A)。 在70, 90,110, 130和150 mg/L噻虫嗪处理烟粉虱陵水种群后，Cardinium感染品系成虫的死亡率比未感染品系低13.93%～25.09%。

图2 不同浓度噻虫嗪处理48 h后烟粉虱MED隐种陵水(A)与寿光(B)种群Cardinium感染与未感染品系成虫的死亡率Fig. 2 Mortalities of adults of Cardinium-infected and uninfected lines of Bemisia tabaci MED from Lingshui (A) and Shouguang (B) populations at 48 h after exposure to different concentrations of thiamethoxamC-: 烟粉虱MED隐种未感染Cardinium的品系Cardinium-uninfected line of B. tabaci MED; C*+: 烟粉虱MED隐种感染Cardinium的品系Cardinium-infected line of B. tabaci MED. 图中数据为平均值±标准误；星号示两组间差异显著(P<0.05, Mann-Whitney U检验)。Data in the figure are means±SE. The asterisk indicates significant difference between the groups (P<0.05, Mann-Whitney U test). 图3同The same for Fig. 3.

与陵水种群的结果不同，寿光种群在100, 150, 175和200 mg/L噻虫嗪处理后，Cardinium感染品系成虫的死亡率均显著高于未感染品系(P<0.05)(图2: B)。

2.3 Cardinium感染与未感染品系对吡虫啉的耐药性比较

吡虫啉的处理结果与噻虫嗪的结果具有同样趋势，即Cardinium感染对烟粉虱陵水与寿光种群对吡虫啉的耐药性具有不同影响。不同浓度吡虫啉处理后，烟粉虱陵水种群Cardinium感染品系成虫死亡率均显著低于未感染品系(P<0.05)(图3: A)。100 mg/L吡虫啉处理陵水种群后，Cardinium感染品系的成虫死亡率比未感染品系低14.50%。

图3 不同浓度吡虫啉处理48 h后烟粉虱MED隐种陵水(A)与寿光(B)种群Cardinium感染与未感染品系成虫的死亡率Fig. 3 Mortalities of adults of Cardinium-infected and uninfected lines of Bemisia tabaci MED from Lingshui (A) and Shouguang (B) populations at 48 h after exposure to different concentrations of imidacloprid

而烟粉虱寿光种群Cardinium感染品系在175和200 mg/L吡虫啉处理后的成虫死亡率则显著高于未感染品系(P<0.05)(图3: B)，前者死亡率分别高于未感染品系的11.90%和10.62%。

2.4 不同种群Cardinium感染与未感染品系对噻虫嗪和吡虫啉的耐药性比较

分别测定了烟粉虱不同种群成虫噻虫嗪和吡虫啉处理的LC50值(表2)。其中，陵水种群Cardinium感染品系两种药剂的LC50均高于Cardinium未感染品系，其抗性倍数(resistance ratio, RR)分别为1.355和1.847。寿光种群Cardinium感染品系两种药剂的LC50均低于Cardinium未感染品系，其RR分别为0.790和0.847。

表2 烟粉虱MED隐种陵水与寿光种群Cardinium感染与未感染品系成虫对噻虫嗪和吡虫啉的耐药性Table 2 Tolerance of adults of Cardinium-infected and -uninfected lines of Bemisia tabaci MEDfrom Lingshui and Shouguang to thiamethoxam and imidacloprid

3 讨论

近年来，尽管国内外学者已对烟粉虱内共生菌进行了深入研究(Renetal., 2020, 2021; Wangetal., 2020)，但其中对Cardinium的研究相对较少(Lvetal., 2021)。对土著烟粉虱Asia II7隐种研究发现，Cardinium与Wolbachia共同感染会导致烟粉虱宿主产生杀雄效应，同时该效应随Cardinium滴度增加而增强(Lvetal., 2021)。在入侵烟粉虱MED隐种中发现，相对于Cardinium未感染种群，烟粉虱感染种群的适合度下降(Fangetal., 2014; Zhaoetal., 2018)；进一步分析表明这可能与该菌影响宿主的生理代谢相关(Lietal., 2018a, 2018b)。然而，Cardinium的感染与对烟粉虱MED隐种对新烟碱类杀虫剂耐药性的影响尚不清楚。

本研究发现，烟粉虱陵水种群次生内共生菌Cardinium感染品系相较于Cardinium未感染品系对噻虫嗪的敏感性显著性降低(图2: A)，此外，陵水种群C*+品系对吡虫啉的敏感性相比较C-品系也显著性降低(图3: A)。而寿光种群Cardinium感染品系相较于Cardinium未感染品系对噻虫嗪(图2: B)和吡虫啉(图3: B)的敏感性则显著性增强。这些结果表明，内共生菌Cardinium感染能影响烟粉虱MED隐种对噻虫嗪和吡虫啉的耐药性。这与近年来越来越多的研究发现“内共生菌能够影响宿主昆虫的耐药性”(段入心等, 2019)是一致的。一方面，研究发现某些内共生菌感染可提高宿主耐药性(Gressel, 2018)。例如，内共生菌Burkholderia可提高点蜂缘蝽Riptortuspedestris对杀螟硫磷的耐药性(Kikuchietal., 2012)。另一方面，也有研究表明有些内共生菌并不能增强宿主昆虫对杀虫剂的耐药性，有些反而会增加宿主昆虫对特定类型杀虫剂的敏感性(Pangetal., 2018; Skaljacetal., 2018)。如对以色列烟粉虱MED隐种种群研究发现，相对于单独感染Arsenophonus的品系，双感染Rickettsia-Arsenophonus品系或双感染Wolbachia-Arsenophonus品系对啶虫脒、噻虫嗪、螺甲螨酯、吡丙醚等杀虫剂的敏感性增加(Ghanim and Kontsedalov, 2009)。

有趣的是，本研究结果同时也表明Cardinium感染对烟粉虱MED隐种耐药性的影响在不同种群间存在差异(图2和3)。前人研究发现，共生菌在宿主中影响往往与宿主的遗传背景密切联系(Cassetal., 2016)。例如，Wolbachia能增强某些灰飞虱种群对常用杀虫剂噻嗪酮的抗性，而在其他种群中不起作用(Lietal., 2020)。我们利用2b-RAD技术对全国烟粉虱MED隐种分析发现，陵水种群与其他地区种群存在明显不同(未发表资料)。因此，本研究中Cardinium感染对宿主烟粉虱耐药性的影响在不同种群的差异，可能与烟粉虱遗传背景不同有关。

目前，内共生菌Cardinium影响烟粉虱MED隐种耐药性的机制尚不清楚。前人研究表明内共生菌可以直接或间接影响昆虫宿主的解毒代谢功能，进而提升昆虫在农药胁迫中的适应力与竞争力(张云骅等, 2019)。 亚致死浓度吡虫啉对褐飞虱Nilaparvatalugens进行胁迫处理可显著提高褐飞虱中Wolbachia的滴度以及褐飞虱体内NlCYP4CE1的转录水平，但用四环素清除Wolbachia后，这种作用明显减弱(Caietal., 2021)。此外，某些内共生菌对农药中特定化学成分具有解毒代谢作用(Blanton and Peterson, 2020)。例如，点蜂缘蝽内共生菌Burkholderia被证实具有水解杀螟硫磷的作用(Singh, 2009)。本研究中，杀虫剂是否影响烟粉虱MED隐种内共生菌Cardinium的滴度，Cardinium的滴度是否对烟粉虱MED隐种耐药性存在影响，该菌影响烟粉虱MED隐种耐药性的机制以及在不同遗传背景中的差异，这些问题尚需进一步的研究。

本研究结果对于揭示烟粉虱MED隐种的种群适应性及扩张机制具有重要参考价值。前期研究发现，海南地区烟粉虱MED隐种种群Cardinium感染率比山东地区烟粉虱MED隐种的要高(未发表资料)，这可能与新烟碱类杀虫剂的使用以及感染该菌对烟粉虱耐药性的影响差异有关。