淫羊藿苷对cuprizone诱导精神分裂症样小鼠模型行为学变化、髓鞘脱失及神经炎性反应的影响

陈 溪 马登磊 李 林*

(1. 首都医科大学宣武医院药学部 北京市神经药物工程技术研究中心，北京 100053； 2. 北京医药集团职工大学药学系，北京 100079)

精神分裂症是以认知力和情感深度分裂为特征的一种疾病，表现为最基本的人类行为受到影响，例如语言、思想、知觉和自我感知等，全球范围内患病率约为1%，严重影响患者及家人的生活[1]。该疾病症状主要包括有阳性症状、阴性症状以及认知方面的障碍。阳性症状包括幻想、错觉、思维紊乱以及行为怪诞；阴性症状包括行为动机低下、情感反应淡漠、失语症以及兴奋能力低下。同时，大多数的精神分裂症患者都有认知能力损伤的症状，主要是与处理任务的信息缺失有关[2]。

白质是中枢神经系统的重要组成部分，是神经纤维聚集的地方，中枢神经细胞的髓鞘损害，会引起白质病变。精神分裂症患者出现白质神经纤维的异常，如髓鞘的变化、轴突的紊乱等，而且多发性硬化等脱髓鞘疾病可出现精神障碍症状。研究[3]显示，神经白质病变与精神障碍和一些神经系统疾病的发病机制密切相关。双环己酮草酰二腙(cuprizone)是一种铜离子螯合剂，能够螯合铜离子从而导致铜离子依赖的一系列酶如线粒体酶、细胞色素氧化酶以及单胺氧化酶等被抑制，从而选择性诱导少突胶质细胞(髓鞘形成细胞)凋亡，引发髓鞘脱失[4]。若连续以含0.2%(质量分数)cuprizone饲料饲喂小鼠5～6周，小鼠出现明显的行为学改变，而且脑内胼胝体部位的髓鞘会出现脱失[5]。该模型具有病程易控制，重现性高等特点，已用于抗精神分裂症药物的研究[6-7]。

研究[8]显示，炎性反应和免疫功能异常可能与精神分裂症的发生、发展有密切关系。在精神分裂症患者和具有精神分裂高风险的患者大脑内，小胶质细胞更活跃，表明神经炎性反应是精神分裂的一个重要因素，并成为治疗和预防精神分裂症的一个新的潜在目标。长期暴露于慢性不可预知性应激也可导致小胶质细胞的形状及功能发生改变，而这种应激及其诱发的炎性反应同样也是导致人类出现精神障碍的最首要原因之一[9]。

淫羊藿是我国常用的经典中药，具有温阳补肾、强筋健骨、祛风除湿等功效。淫羊藿苷是淫羊藿的主要有效成分，具有很好的抗炎作用[10]。笔者[11]前期研究发现，淫羊藿苷能够改善N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体拮抗剂MK-801致精神分裂症小鼠模型的阴性症状和阳性症状。本研究拟应用cuprizone致脱髓鞘小鼠模型，研究淫羊藿苷对精神分裂症样行为学变化、脑白质部位髓鞘脱失及神经炎性反应的影响，为抗精神分裂症新药的研发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物

淫羊藿苷(icariin，ICA)，高效液相色谱 (high performance liquid chromatography，HPLC)检测纯度为99.09%，购自陕西宝鸡市辰光生物科技有限公司。

1.2 实验动物及分组

C57BL/6雄性小鼠，6周龄，体质量(20±2)g，SPF级，购自首都医科大学实验动物中心，实验动物合格证号：11400700106244。小鼠采用数字表法随机分为正常对照组、模型组、模型+ICA低剂量(25 mg/kg)和高剂量(50 mg/kg)组，每组8只。

1.3 动物造模方法

先适应饲养环境3 d，然后除了对照组给予正常饲料以外，其他各组均喂饲含0.2%(质量分数)cuprizone的饲料进行造模。造模的同时各组灌胃给予相应剂量的药物，每日一次，连续5周，然后进行行为学测试。

1.4 Y-迷宫试验

Y迷宫由3个完全相同的臂组成。Y-迷宫试验的进臂次数可反映小鼠的活动情况，自发性交替反应率可反映小鼠的空间工作记忆情况。自发性交替反应(alternation)检测方法：将小鼠放在一个臂的末端，记录8 min内动物进入各个臂的顺序。Alternation被定义为连续进入3个臂(如1，2，3或1，3，2)，最大alternation 为进臂次数的总和-2，然后计算：自发性交替反应率(%)=实际的alternation/最大alternation×100%。

1.5 旷场试验

旷场试验(open field test)的设备由旷场反应箱、数据自动采集和处理系统组成。旷场反应箱底边长72 cm，高25～30 cm，内壁为黑色，底面平均划分为64个小方格。正上方架一数码摄像头，拍摄范围覆盖整个旷场内部。首先将小鼠放入旷场反应箱内中心区域，同时开始进行摄像和计时。记录小鼠10 min内的自发活动总距离，距离越长表示活动性越高，可反映精神分裂症高活动性阳性症状。

1.6 动物脑组织取材与切片

小鼠麻醉后分别灌注0.9%(质量分数)氯化钠注射液(以下简称生理盐水)及4%(质量分数)多聚甲醛固定液。固定后取出脑组织。脱水后在冰冻切片机(美国Thermo公司)中行冠状位冰冻切片，切片厚度为40 μm。

1.7 油红O染色

冰冻切片提前切片，呈于载玻片上，稍做晾干。把晾干的载玻片放在盛有水的湿盒中，保持环境湿润。配制油红O工作液，静止10 min后过滤使用，建议过滤两次染色效果更佳。用60%(体积分数)乙醇分色1 min，流水漂洗1 min。苏木精复染细胞核15 s左右。盐酸乙醇分色20 s，流水清洗1 min。放置稍做晾干，切不可太过干燥，甘油明胶封片。

1.8 免疫组织化学方法

应用免疫组织化学法检测髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)表达、Iba-1标记的小胶质细胞和GFAP标记的星形胶质细胞。小鼠脑冰冻切片提前切片，置于载玻片上，10%(体积分数)血清封闭。室温封闭2 h 后，分别孵育一抗：兔抗MBP抗体(1∶2 000稀释，美国Sigma公司)、抗Iba-1抗体(1∶500稀释，日本Wako公司)、抗GFAP抗体(1∶100稀释，美国Santa Cruz公司)，4 ℃过夜。PBST洗去一抗后，加入二抗(生物素结合的羊抗兔IgG抗体，1∶100稀释，北京中杉金桥生物技术公司)及三抗(辣根酶标记的链霉卵白素抗体，1∶100稀释，北京中杉金桥生物技术公司)。PBST漂洗后用DAB显色液进行显色(北京中杉金桥生物技术公司)。脱水，中性树胶封片，在光学显微镜(日本Olympus公司)下观察和拍照。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 淫羊藿苷对cuprizone模型小鼠行为学变化的影响

2.1.1 Y迷宫试验

与对照组相比，cuprizone模型小鼠的进臂次数略有增高，ICA(25、50 mg/kg)灌胃给药5周显著减低了模型小鼠的进臂次数(P<0.01，图1A)。此外，模型小鼠的自发性交替反应率明显减低(P<0.01)，ICA(25 mg/kg)给药可以明显增高模型小鼠的自发性交替反应率(P<0.05，图1B)。

图1 淫羊藿苷对cuprizone模型小鼠Y-迷宫试验的影响Fig.1 Effect of icariin (ICA) on Y-maze test in cuprizone model miceA: arm entrance; B: percentage of alternation behavior；*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs model group；##P<0.01 vs control group.

2.1.2 旷场试验

与对照组相比，cuprizone模型小鼠10 min内的自发活动总距离显著延长(P<0.01)，ICA(25、50 mg/kg)灌胃给药能够明显缩短模型小鼠的自发活动总距离(P<0.05,图2)。

图2 ICA对cuprizone模型小鼠自发活动总距离的影响(旷场试验)Fig.2 Effect of ICA on the total distance of spontaneous activity in cuprizone model mice (open field test)##P<0.01 vs control group; *P<0.05, **P<0.01 vs model group; ICA: icariin.

2.2 ICA对cuprizone模型小鼠胼胝体部位髓鞘脱失的影响

2.2.1 油红O染色

正常对照组小鼠胼胝体着色面积广，着色程度高，而cuprizone模型组的着色面积和着色程度都显著

降低。灌胃给予ICA(25、50 mg/kg)能够显著增加模型小鼠胼胝体的油红O着色面积和着色程度(图3)。

2.2.2 免疫组织化学染色

采用免疫组织化学法检测脑内MBP的表达。与正常对照组相比，cuprizone模型组小鼠胼胝体部位MBP表达明显降低。ICA(25、50 mg/kg)能够显著升高模型小鼠脑内MBP表达(图4)。

2.3 ICA对cuprizone模型小鼠脑内神经炎性反应的影响

2.3.1 小胶质细胞

采用免疫组织化学方法检测以Iba-1标记的小胶质细胞。与正常对照组相比，cuprizone模型组小鼠胼胝体部位小胶质细胞数量明显增多(P<0.01)；ICA(50 mg/kg)灌胃给药能够明显减少模型小鼠小胶质细胞数量(P<0.01,图5)。

图5 ICA对cuprizone模型小鼠胼胝体部位小胶质细胞活化的影响Fig.5 Effect of ICA on microglia activation in the corpus callosum of cuprizone model miceA: representative immunohistochemical images, microglia labeled with Iba-1. Scale bar=50 μm; B: number of microglia. ##P<0.01 vs control group，**P<0.01 vs model group; ICA: icariin.

2.3.2 星形胶质细胞

采用免疫组织化学方法检测以GFAP标记的星形胶质细胞。与正常对照组相比，cuprizone模型组小鼠胼胝体部位星形胶质细胞数量明显增多(P<0.01)。 ICA(50 mg/kg)灌胃给药能够明显减少模型小鼠星形胶质细胞数量(P<0.01，图6)。

图6 ICA对cuprizone模型小鼠胼胝体部位星形胶质细胞的影响Fig.6 Effect of ICA on astrocytes in the corpus callosum of cuprizone model miceA: representative immunohistochemical images, astrocytes labeled with GFAP. Scale bar=50 μm. B: number of astrocytes. ##P<0.01 vs control group，**P<0.01 vs model group; ICA: icariin.

3 讨论

Cuprizone介导的脱髓鞘模型在胼胝体、海马、嗅球、视交叉、脑干、小脑、纹状体、皮质、扣带回等脑区可见到明显的脱髓鞘病灶[12]。基于本模型小鼠行为学改变以及病理改变与精神分裂症患者具有一致性，使得cuprizone诱导的脱髓鞘模型成为研究精神分裂症白质损伤及治疗研究的动物模型[13]。

Y-迷宫试验和旷场试验是用来评价精神分裂症动物模型行为学变化的常用方法[14]。Y-迷宫的自发交替行为可用于检测精神分裂症模型小鼠的空间工作记忆能力(反映认知功能)，进臂次数检测模型小鼠的高活动性(反映阳性症状)。旷场试验的活动总距离亦可用于检测精神分裂症模型小鼠的高活动性(反映阳性症状)[4]。本研究结果显示，cuprizone模型小鼠在Y-迷宫试验中的自发交替反应率降低，反映出记忆功能减退；在旷场试验中的活动总距离延长，反映出高活动性阳性症状，表明模型成功模拟了精神分裂症的症状。对模型小鼠给予ICA，能够显著增高Y-迷宫试验的自发性交替反应率，并减少Y-迷宫试验的进臂次数、缩短旷场试验中的活动总距离，表明ICA能够明显改善模型小鼠的记忆功能障碍和高活动性阳性症状，提示ICA具有抗精神分裂症潜能。由于目前临床缺乏改善认知障碍的抗精神病药物，ICA的改善记忆作用尤其值得关注。

大脑白质位于皮质深面，有髓神经纤维是大脑白质的主要组成部分，有髓纤维由髓鞘及其包覆的神经轴突构成。近年来，随着影像学技术的发展，轴突损伤造成的各脑区间联系紊乱成为精神分裂症病因学的重要假说[15]。磁共振-弥散张量成像研究[1,3]显示，精神分裂症患者脑内白质体积减小，出现髓鞘脱失、轴突紊乱等白质纤维的异常，提示髓鞘病变与精神分裂症的发病机制密切相关。髓鞘损伤可造成高级认知功能障碍，进而影响患者的认知功能。MBP是轴突髓鞘化的标志性蛋白，是髓鞘的主要组成成分。研究[16]显示，精神分裂症患者大脑前额叶皮质存在MBP等髓鞘形成相关蛋白的低表达。本研究采用油红O染色和MBP免疫组织化学方法，发现cuprizone模型小鼠脑白质胼胝体部位出现明显的髓鞘脱失，MBP表达减少，该结果与Zhang等[17]的报道一致。而ICA能够明显改善模型小鼠胼胝体部位的髓鞘脱失状况，增高MBP的表达，这可能是ICA改善cuprizone模型小鼠行为学变化的重要机制之一。

近年来的证据[18]表明，炎性反应及免疫功能异常很可能与精神分裂症的发病有密切关系。围产期的感染是精神分裂症的高发因素，对围产期的小鼠注射细菌内毒素(脂多糖)能够作为精神分裂症动物模型的造模手段，也为炎性反应参与精神分裂症的发生提供了有力的证据。炎性反应可以通过能够抑制神经发生、促进神经细胞的凋亡、抑制髓鞘的形成等，参与精神分裂症的机制。同时，临床研究[19]的结果也显示抗炎药物能够改善精神分裂症患者的部分症状，进而使精神分裂症的炎性反应假说受到关注。本研究中，cuprizone模型小鼠胼胝体部位小胶质细胞和星形胶质细胞数量增多。ICA能够明显减少模型小鼠胼胝体部位小胶质细胞和星形胶质细胞数量，抑制炎性细胞活化。结果提示，ICA的抗神经炎性反应作用可能是其治疗精神分裂症的作用机制之一。

综上所述，对于cuprizone诱导的精神分裂症模型小鼠，ICA能够改善高活动性阳性症状和认知功能障碍，并能够改善髓鞘脱失的病理改变，拮抗神经炎性反应，可能成为具有抗精神分裂症潜能的候选药物。