HPLC法同时测定姜枣祛寒颗粒中4种成份的含量

孟建升，蒋俊春，郑志安，韩知利，肖红伟，王 辉

(1 商丘市食品药品检验检测中心，商丘 476001；2 中国农业大学工学院，北京 100083)

姜枣祛寒颗粒由干姜和大枣加工而成，具有发散祛寒、和胃温中的功效。临床主要用于风寒感冒、胃寒疼痛。收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第二册[1]，干姜为方中君药，为姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根茎，具有温中散寒、回阳通脉、温肺化饮的功效[2]，其有效成份为姜酚和姜烯酚，包括6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚等[3]。现行质量标准及相关研究仅对姜枣祛寒颗粒中的6-姜辣素进行定量研究[4]，未检索到对姜酚类成份测定的报道。为全面评价姜枣祛寒颗粒的质量，本研究建立高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法同时测定姜枣祛寒颗粒中6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚的含量，并进行方法学验证。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；XS-205DU电子分析天平[梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司]；SB-800DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 试药

6-姜酚对照品(上海麦克林生化科技有限公司，批号：M00118003，纯度≥90%)；8-姜酚对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：P24A10F96114，纯度≥98%)；6-姜烯酚对照品[阿拉丁试剂(上海)有限公司，批号：G1915196，纯度≥98%]；10-姜酚对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：P20N6F6295，纯度≥98%)；姜枣祛寒颗粒(甘肃中天金丹药业有限公司，国药准字Z62021207，规格15 g/袋，批号：180602、180903、181105、190703、190906、191108)；乙腈(德国默克公司，色谱纯)；水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1对照品溶液的制备

分别精密称取6-姜酚对照品、8-姜酚对照品、6-姜烯酚对照品、10-姜酚对照品适量，加80%甲醇溶液制成浓度分别为0.1470、0.1824、0.1194、0.1012 mg/ml的混合对照品储备液，置5 ℃±3 ℃冰箱中冷藏储存。精密量取上述混合对照品储备液5.00 ml，置25 ml量瓶中，加80%甲醇溶液至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备

取供试品适量，置研钵中，研细，取约0.5 g，精密称定，置50 ml量瓶中，加80%甲醇30 ml，超声处理30 min，放至室温，加80%甲醇溶液至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液[5-6]。

2.1.3阴性对照溶液的制备

取大枣，按照姜枣祛寒颗粒的制备工艺制作阴性样品，按照“2.1.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.2 色谱条件

Thermo Syncronis C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱(见表1)，流速1.0 ml/min，检测波长280 nm，进样量20 μl，柱温30 ℃[7-9]。

表1 梯度洗脱程序

2.3 专属性考察

取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪，按照“2.2”项下色谱条件进行测定，结果见图1。表明4种对照品在相应的主峰位置分离良好，不受干扰。

A:混合对照品;B:供试品;C:阴性对照1: 6-姜酚；2: 8-姜酚；3: 6-姜烯酚；4: 10-姜酚图1 高效液相色谱图

2.4 方法学验证

2.4.1线性关系考察

精密量取混合对照品储备液0.5、1、2、5、10 ml分别置于25 ml量瓶中，加80%甲醇溶液至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，精密吸取滤液20 μl，注入高效液相色谱仪，按照“2.2”项下色谱条件进样测定。以对照品浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归，结果见表2。结果表明，4种成份在各自的浓度范围内均呈良好的线性关系。

表2 4种成份的线性关系

2.4.2精密度试验

精密量取同一供试品溶液(批号：191108)20 μl，连续进样5次。结果：6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚峰面积的RSD(n=5)分别为0.99%、1.24%、1.62%和1.76%，表明精密度良好。

2.4.3稳定性试验

精密量取同一供试品溶液(批号：191108)20 μl，于0、1、2、5、10、15、24 h进行测定。结果：6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚峰面积的RSD分别为1.03%、1.55%、1.29%和1.87%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4重复性试验

精密称取同一供试品细粉(批号：191108)0.5 g，6份，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别测定。结果：6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚峰面积的RSD分别为1.63%、1.74%、1.56%和1.79%，表明该方法重复性良好。

2.4.5加样回收率试验

精密称取已知含量的供试品细粉(批号：191108)0.25 g，9份，精密加入对照品溶液(含6-姜酚浓度为0.1470 mg/ml、8-姜酚浓度为0.0248 mg/ml、6-姜烯酚浓度为0.0387 mg/ml、10-姜酚浓度为0.0427 mg/ml)4、5、6 ml，各3份，按照“2.1.2”项下方法制备溶液，分别测定6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚含量，计算回收率，结果见表3。结果表明各检测指标回收率良好。

表3 加样回收率结果 n=9

2.5 含量测定

取6批样品，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，测定6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚含量，结果见表4。

表4 4种成份含量测定结果 mg/g

3 讨论

3.1 供试品溶液的制备方法选择

姜枣祛寒颗粒是将处方中的饮片加工成流浸膏再制颗粒，考虑到4种成份同时提取测定，本研究分别采用50%甲醇、80%甲醇、甲醇回流提取和超声提取，并进行比较。结果：采用80%甲醇溶液超声30 min所提取的6-姜酚含量最高(见表5)，且操作简便。故选择此方法作为供试品的提取方法。

表5 不同提取溶剂及方式下6-姜酚含量测定结果 mg/g

3.2 流动相的选择

4种成份同时测定，色谱条件的关键在于流动相。本研究采用了不同比例的乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、乙腈-甲醇-水、乙腈-甲醇-磷酸溶液系统进行梯度洗脱。经比较，采用乙腈-水梯度洗脱系统，响应和峰形最好，基线平稳，各指标成份达到基线分离，结果稳定，故选流动相为乙腈-水梯度洗脱系统。

3.3 测定波长、柱温及流速的选择

采用紫外检测器对供试品溶液进行全波长扫描，结果各成份在280 nm均有最大响应，故选择280 nm作为测定波长。在实验期间实验室温度控制在25～30 ℃范围内，实验结果不受影响。为了保持实验条件的一致性，柱温选择30 ℃。流速选择1.0 ml/min，柱压稳定，峰型良好。

3.4 检测成份的选择

据报道[10-11]，姜酮也是生姜的有效成份之一，但是本研究条件下姜酮含量较低，峰型不理想，故未纳入本研究中，后续研究将深入地研究姜酮的提取和分离。

本研究建立的HPLC法同时测定姜枣祛寒颗粒中4种成份的含量，方法简便，易于操作，为该制剂的质量可控提供参考，同时为其他干姜制剂的全面质量控制提供新的方法和思路。