正丁基取代芒果苷的合成工艺优化及活性预测

谭邦银，邓 松，黎 容，唐 铭，朱 军，廖洪利*

(1.成都医学院药学院，四川 成都 610083；2.昆明医科大学药学院，云南 昆明 650500；3.南充市第六人民医院，四川 南充 637700)

乙肝是一种易恶变、难康复、传染性强的疾病，抗乙肝病毒是治疗乙肝的关键。目前临床常用的抗乙肝病毒药物主要是核苷类和干扰素，前者易耐药且治疗效果不突出，后者耐受性差，一般需注射给药[1]，因此，开发高效低毒且使用方便的抗乙肝病毒药物具有重要意义。研究表明，芒果苷具有降糖、抑制HepG2肝癌细胞增殖转移[2-3]、抗乙肝病毒[4]等药理作用。但由于芒果苷油水分配系数极低，不易被吸收，致使其生物利用度低[5]，限制了其广泛应用。若在芒果苷的3-、6-、7-位羟基引入正丁基，则有助于改善芒果苷的油水分配系数，进而提高生物利用度，但按文献报道的合成工艺进行重复实验，收率不稳定。

因此，作者采用正交实验优化正丁基取代芒果苷合成工艺；再利用AutoDock Vina软件[6]，通过计算机模拟正丁基取代芒果苷与抗乙肝病毒的靶点HBV核蛋白、HBX结合蛋白、Bcl-2与HBX-BH3复合体结晶蛋白的结合情况[7-8]，进而预测正丁基取代芒果苷的抗乙肝病毒活性；以最低结合能构象(优势构象)与原构象的均方根偏差(RMSD)是否低于2 Å[6]来评价分子对接结果的可信度；以预测正丁基取代芒果苷可能具有的尚未被发现的药理作用，为后期体外或体内实验提供足够的理论依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

芒果苷(批号2020091202)，西安雅图生物科技有限公司。

溴代正丁烷等试剂，成都市高新区蔚蓝化学试剂公司。

MP120型全自动熔点仪，ZF-Ⅰ型三用紫外分析仪，Specord 50 Plus型紫外分光光度仪，KH2200型超声波清洗器，DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，安捷伦1290型液相色谱-G6400系列三重四级杆质谱联用仪，DZF-6020型真空干燥箱，EYELA N-1100型旋转蒸发仪。

1.2 正丁基取代芒果苷的合成

正丁基取代芒果苷的合成路线如图1所示。

图1 正丁基取代芒果苷的合成路线

取0.42 g(1 mmol)芒果苷于100 mL圆底烧瓶中，加入12 mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，置于恒温油浴锅中，搅拌使芒果苷溶解澄清；再加入研细的无水碳酸钾(缚酸剂)粉末0.50 g(3.6 mmol)、溴代正丁烷0.34 mL(约3 mmol)，40 ℃搅拌反应(接冷凝管、干燥管)5 h，期间反应液颜色逐渐加深；TLC监测反应，当原料点几乎完全消失、出现Rf值比原料点更大的产物点时停止反应，向反应液中加入80 mL乙酸乙酯，搅拌均匀后移至500 mL分液漏斗中；再加入100 mL 2%KOH溶液，充分振摇，静置分层后，分离上层有机相；称取3 g无水硫酸镁加入有机相中，振摇，静置2 h；抽滤，滤液用旋转蒸发仪旋至体积不再减少或得到黄色油状固体；加入20 mL石油醚，超声，析出固体；-18 ℃冷冻12 h，抽滤，置于烘箱中40 ℃干燥1 h，得正丁基取代芒果苷粗品，称重。

1.3 正丁基取代芒果苷的收率计算

精密称量12.30 mg正丁基取代芒果苷粗品于25 mL干燥锥形瓶中，加入3.00 mL乙酸乙酯，超声溶解；加入1.50 mL石油醚，摇匀；再加入0.060 7 g硅胶粉(300～400目)，振摇，静置0～1 min；抽滤，取滤液0.21 mL至50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得样品溶液。测定样品溶液在262 nm处的吸光度，依据标准曲线方程A=0.056c-0.0196(R2=0.9997)计算样品溶液中正丁基取代芒果苷的浓度，按下式计算正丁基取代芒果苷收率(本实验以粗品中正丁基取代芒果苷的质量表征收率W，mg)：

式中：c为依据标准曲线方程计算的正丁基取代芒果苷的浓度，μg·mL-1；n为稀释倍数；V为样品溶液总体积，mL；m1为称取粗品的质量，mg；m2为合成粗品的总质量，mg。

1.4 正丁基取代芒果苷的合成工艺优化

在前期研究的基础上，以反应时间(A)、反应温度(B)、投料比(芒果苷与溴代正丁烷物质的量比，C)、缚酸剂用量(D)为考察因素，以正丁基取代芒果苷收率(W)为考核指标，采用L16(44)正交实验优化正丁基取代芒果苷的合成工艺。正交实验的因素与水平见表1。

表1 正交实验的因素与水平

1.5 正丁基取代芒果苷的抗乙肝病毒活性预测

利用AutoDock Vina软件[6]，在Microsoft Windows 2007操作系统中，运用ChemBioDraw和ChemBio 3D获得能量最小化的芒果苷和正丁基取代芒果苷的3D结构。在PBD数据库中检索并下载与抗乙肝病毒复制、感染相关的靶点蛋白：HBV核蛋白(PBD ID：5E0I)、HBX结合蛋白(HBXIP)(PBD ID：3MS6)、Bcl-2与HBX-BH3复合体结晶蛋白(PBD ID：5FCG)；通过Pymol软件打开各靶点3D模型，保留各靶点自身所带有的配体，删除各靶点中的其它配体分子及水分子，导出为受体pdb文件。分别将受体和配体导入AutoDock tool中，加氢，计算电荷，设置对接参数，进行Vina分子对接。待程序结束，运用Pymol软件，计算优势构象与原构象的RMSD值。以RMSD值是否低于2 Å来评价分子对接结果的可信度，以预测正丁基取代芒果苷可能具有的尚未被发现的药理作用。

将正丁基取代芒果苷优势构象与抗乙肝病毒靶点的复合物导入Pymol软件中，分析正丁基取代芒果苷优势构象与靶点具体氨基酸残基形成的氢键以及氢键的长度，绘制正丁基取代芒果苷优势构象与靶点活性空腔结合的3D图及正丁基取代芒果苷优势构象与靶点氨基酸残基的氢键及其它作用力的2D图。

2 结果与讨论

2.1 正交实验结果

采用L16(44)正交实验优化正丁基取代芒果苷的合成工艺，结果与分析见表2。

表2 正交实验的结果与分析

由表2可知，4个因素对正丁基取代芒果苷收率的影响大小依次为反应温度(B)>反应时间(A)>投料比(C)>缚酸剂用量(D)。在实验选定的数据范围内，分析均值的变化趋势，综合考虑合成成本，得到正丁基取代芒果苷的最优合成工艺组合是A2B4C3D3，即反应时间4 h、反应温度60 ℃、芒果苷与溴代正丁烷物质的量比1∶6.0、缚酸剂碳酸钾用量0.58 g。

2.2 验证实验

在最优工艺条件下，进行2次验证实验，正丁基取代芒果苷收率分别为177.42 mg和183.72 mg，均大于16次正交实验中的最大值。表明，采用正交实验优化的合成工艺合理可行，正丁基取代芒果苷收率可观且相对稳定。

2.3 抗乙肝病毒活性预测结果

分子模拟芒果苷、正丁基取代芒果苷与抗乙肝病毒的靶点HBV核蛋白、HBX结合蛋白、Bcl-2与HBX-BH3复合体结晶蛋白的结合情况，最低结合能及RMSD值见表3。

表3 分子模拟的最低结合能及RMSD值

由表3可知，芒果苷、正丁基取代芒果苷与抗乙肝病毒各靶点的结合能均低于-6.0 kcal·mol-1，其中与核心靶点HBV核蛋白的结合能最低，分别为-8.9 kcal·mol-1和-8.7 kcal·mol-1；各优势构象与原构象的RMSD值均低于2 Å，提示正丁基取代芒果苷可能具有一定的抗乙肝病毒活性。

2.4 正丁基取代芒果苷与抗乙肝病毒靶点结合情况

对正丁基取代芒果苷与HBV核蛋白、HBX结合蛋白、Bcl-2与HBX-BH3复合体结晶蛋白等3个靶点的对接结果进行分析，分别绘制正丁基取代芒果苷优势构象与靶点的结合情况、优势构象与靶点活性空腔的适应情况、优势构象与靶点氨基酸残基的作用力情况，结果如图2所示。

由图2可知，正丁基取代芒果苷能够与抗乙肝病毒靶点很好地结合(图2a～c)；并顺利进入3个靶点的活性区域(图2d～f)；与附近的靶点氨基酸残基形成氢键及其它类型的作用力，其中与HBV核蛋白的102、106、121、156等4个氨基酸残基形成氢键，与HBX结合蛋白的8、12、23等3个氨基酸残基形成氢键，而与Bcl-2与HBX-BH3复合体结晶蛋白形成氢键较少，只与145氨基酸残基有1个氢键结合(图2g～i)。

a、b、c分别为正丁基取代芒果苷优势构象与HBV核蛋白、HBX结合蛋白、Bcl-2与HBX-BH3复合体结晶蛋白的结合情况d、e、f分别为正丁基取代芒果苷优势构象与HBV核蛋白、HBX结合蛋白、Bcl-2与HBX-BH3复合体结晶蛋白活性空腔的适应情况g、h、i分别为正丁基取代芒果苷优势构象与HBV核蛋白、HBX结合蛋白、Bcl-2与HBX-BH3复合体结晶蛋白氨基酸残基的作用力情况

2.5 讨论

乙肝是一种慢性疾病，全球共有3.5亿乙肝患者，而中国是感染人数最多的37个国家之一[9]。临床常用的治疗方法是抗病毒治疗，其治疗周期长，常用的抗病毒药物核苷类和干扰素，长期使用都有一定缺陷。本研究采用分子对接的方式，在理论上验证了正丁基取代芒果苷具有与芒果苷相似的抗乙肝病毒活性，且经过结构修饰后，其油水分配系数较芒果苷有很大的改善，具有良好的研究前景。但其原有的合成工艺存在收率不稳定的缺点。因此，本研究采用正交实验对原合成工艺进行优化，最终获得了一条可以降低成本、提高收率稳定性的合成工艺。

3 结论

以芒果苷和溴代正丁烷为原料，合成正丁基取代芒果苷，采用L16(44)正交实验优化合成工艺，确定最优合成工艺如下：反应时间4 h、反应温度60 ℃、芒果苷与溴代正丁烷物质的量比1∶6.0、芒果苷用量1 mmol、缚酸剂碳酸钾用量0.58 g，在此条件下，2次验证实验得到的正丁基取代芒果苷收率分别为177.42 mg和183.72 mg。正丁基取代芒果苷与抗乙肝病毒各靶点的结合能均低于-6.0 kcal·mol-1，其中与核心靶点HBV核蛋白的结合能最低(-8.7 kcal·mol-1)，各优势构象与原构象的均方根偏差(RMSD)均低于2 Å，对接结果可信度较高。通过分子对接预测了正丁基取代芒果苷的抗乙肝病毒活性，为该类化合物的进一步研究奠定了基础。