双靶点抗阿尔兹海默症药物的设计、合成与体外抑制活性

陈 丹，许 莉，秦 飞，祝珊珊，罗联忠*

(1.厦门医学院药学系，福建 厦门 361023；2.厦门医学院 厦门市海洋药用天然产物资源重点实验室，福建 厦门 361023；3.厦门医学院 海洋生物医药资源福建省高校工程研究中心，福建 厦门 361023)

阿尔兹海默症(AD)是一种多因素的复杂疾病，其具体发生机制尚不明确，目前针对AD的治疗措施很有可能是基于错误的病理学机制。在早期，基于胆碱能假说开发了几种以乙酰胆碱酯酶(AChE)为靶点的化合物来提高脑中乙酰胆碱(ACh)水平，如他克林[1]、多奈培齐[2]、利伐替明[3]、加兰他敏[4]等，但这些药物只能缓解疾病症状，之后开发的谷氨酸盐保护剂美金刚[5]也只能单纯缓解疾病症状。从上市药物的作用机制来看，它们只与乙酰胆碱酯酶的中心催化位点相互作用。加利福尼亚电鳐乙酰胆碱酯酶(TcAChE)的晶体结构显示其活性位点位于一个又深又窄的峡谷(20 Å)底部，该峡谷被称为“活性位点峡谷”或“芳香峡谷”[6]。在活性位点，催化三联体负责水解乙酰胆碱中的酯键；保守残基Trp279是第二结合位点的主要组成部分，被称为外周“阴离子”位点(PAS)，由Tyr70、Asp72、Tyr121、Trp279和Tyr334氨基酸残基组成，距离峡谷顶部附近的活性位点14 Å[7]。大量研究证明，乙酰胆碱酯酶是β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)[8]聚集积累过程中最重要的分子伴侣，它可以加速β-淀粉样蛋白的聚集，诱导β-淀粉样蛋白的积累，并与之结合形成稳定复合物，从而增强其神经毒性。也有研究表明，暴露在乙酰胆碱酯酶表面的关键残基Trp279导致β-淀粉样蛋白聚集[9]。还有研究证实了多靶点配体(MTDL)在痴呆动物模型中的有效性[10-12]，为AD治疗提供了新的方向。

近年来，有许多抗AD药物以及对AD具有潜在治疗效果的药物，在经过临床试验后因种种原因先后被放弃，如在Ⅲ期临床试验中失败的γ-分泌酶抑制剂Semagacestat(LY450139)[13]、γ-分泌酶抑制剂(R)-氟比洛芬、不可逆性胆碱酯酶抑制剂甲硝唑、胆碱酯酶和NMDA受体拮抗剂拉地吡啶等。越来越多的研究人员认为，AD是由多病原引起的疾病，因此寻找多靶点药物成为新的研究趋势[6]。常见的靶点有乙酰胆碱酯酶、β-淀粉样蛋白、Tau蛋白等。因此，发现和开发有效的同时与中心催化位点和外周活性位点相互作用的多靶点抗AD药物是目前研究者关注的焦点。

1 实验

1.1 基于先导化合物的虚拟筛选

传统中草药骆驼蒿(PeganumnigrllastrumBunge)是蒺藜科骆驼蓬属植物，其全株可入药，有清热、消炎、祛湿、杀虫的作用。骆驼蒿的枝叶和种子含有多种生物碱，可治疗风湿痹痛、无名肿毒。现代药理研究证明，骆驼蒿生物碱具有降血糖[14]和抗癌作用[15]。从骆驼蒿的甲醇提取物中分离到多种生物碱，包括脱氧鸭嘴花碱酮，其体外生物实验显示其对乙酰胆碱酯酶有轻微的抑制作用[16]。因此，作者以脱氧鸭嘴花碱酮(图1)为先导化合物，设计并合成脱氧鸭嘴花碱酮衍生物，通过测定其半数最大抑制浓度(IC50)来评价其体外抑制活性。

利用MOE研究脱氧鸭嘴花碱酮与乙酰胆碱酯酶的结合模式，筛选设计了一系列不同取代基的脱氧鸭嘴花碱酮衍生物Ⅰ1～Ⅰ4、Ⅱ1～Ⅱ4(图2)。衍生物的ASE评分(MOE中可靠的评分函数)越低，相互作用力越强；IC50值越低，抑制作用越强。

图2 虚拟筛选的脱氧鸭嘴花碱酮衍生物的结构式

1.1.1 酶蛋白的处理

由于人乙酰胆碱酯酶(hAChE)与TcAChE具有高度的序列同一性，所以选择从Protein Data Bank20中获得的TcAChE与加兰他敏衍生物(1W6R)的复合物的晶体结构作为受体蛋白分子对接的侧链开口构象，从蛋白质数据库下载的蛋白质PDB编号为1QTI[17]。

具体操作步骤及参数设置如下：除去复合物中的配体和水分子，添加氢原子(All)、AMBER7 FF99电荷；活性口袋定义为与加兰他敏中任一原子的距离在1.0 nm范围内的所有氨基酸残基；用MOL2格式输出用于Gold计算。

1.1.2 配体小分子的处理

首先构建目标小分子，修正配体分子中原子和键的类型，添加氢原子，并对小分子配体进行能量优化，添加氢原子和Gasteiger-Marsili[18]电荷。然后运用Tripos[19]力场对小分子进行1 000步的分子力学优化，迭代算法为Powell，迭代终止条件为能量梯度0.005 kca1·mo1-1·A-1，非键相互作用截断值为10.0，介电常数为78.0，以MOL2格式保存。

1.1.3 分子对接的参数设置

将得到对接口袋片段的蛋白质作为分子对接的靶标，将以TcAChE复合物中的小分子配体为中心、10 Å半径空间内的所有氨基酸残基片段定义为活性口袋。对接采用默认的GA设置，设置配体柔性的选项，限制原子和键的浮动，每个配体分子对接500个循环。

1.2 脱氧鸭嘴花碱酮衍生物的合成

1.2.1 试剂与仪器

邻苯二甲酰亚胺、氢氧化钠、亚硫酸氢钠、无水冰醋酸、4-氨基丁酸、二碳酸二叔丁酯、碳酸氢钾、四氢呋喃、正丁醇、茚三酮、乙酸乙酯、柠檬酸、无水硫酸镁、2-吡咯烷酮、三氯氧磷、二氯甲烷、己内酰胺、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、2-氨基-4-氯苯甲酸、戊二醛、无水醋酸钠、3A分子筛、对二甲胺基苯甲醛、环己烷、正己烷、三氯甲烷、柱层析硅胶，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

DHJF-2005型低温反应釜，郑州长盛实验仪器有限公司；SHZ-D(Ⅲ) 型循环水式多用真空泵，巩义予华仪器有限责任公司；C-MAG HS 7型磁力搅拌器、RV10 digital型数显旋转蒸发仪、HB10 digital型恒温水浴锅，IKA；101型电热鼓风干燥箱，中兴仪器设备有限公司；XMTD-8222型真空干燥箱，精宏仪器设备有限公司；ZF-2型三用紫外仪，上海安亭电子仪器厂。

1.2.2 合成方法

在三氯氧磷的存在下合成脱氧鸭嘴花碱酮衍生物Ⅰ1～Ⅰ4，三氯氧磷由于其良好的脱水性能，捕获了缩合反应产生的水分子。通过衍生物Ⅰ1～Ⅰ4与对二甲胺基苯甲醛[20]的亲核加成反应合成衍生物Ⅱ1～Ⅱ4。反应机理类似于醛缩合反应，氮原子附近碳原子上的氢被亚氨基活化，形成碳负离子作为亲核试剂攻击对二甲胺基苯甲醛，最终产物产率较高。合成路线如图3所示。

图3 脱氧鸭嘴花碱酮衍生物的合成路线

1.2.2.1 2,3-二氢吡咯并[2,1-b]喹唑啉-9(1H)-酮(Ⅰ1)的合成

将1.37 g(10 mmol)邻氨基苯甲酸(参照文献[21]合成，下同)、1.14 mL(11 mmol)2-吡咯烷酮和6 mL三氯氧磷依次加入到100 mL带搅拌器的圆底烧瓶中，100 ℃无水条件下回流1 h；自然冷却后，将反应物倾入碎冰中，用碳酸氢钾溶液调节体系pH值至8，用100 mL二氯甲烷萃取3次，减压旋蒸除去溶剂；以二氯甲烷为洗脱剂用柱层析色谱分离产物，得衍生物Ⅰ11.246 g，产率67%。

1.2.2.2 7,8,9,10-四氢氮杂并[2,1-b]喹唑啉-12(6H)-酮(Ⅰ2)的合成

将1.37 g(10 mmol)邻氨基苯甲酸、1.695 g(15 mmol)己内酰胺和6 mL三氯氧磷依次加入到100 mL带搅拌器的圆底烧瓶中，100 ℃无水条件下回流1 h；自然冷却后，将反应物倾入碎冰中，用碳酸氢钾溶液调节体系pH值至8，用100 mL二氯甲烷萃取3次，减压旋蒸除去溶剂；以二氯甲烷为洗脱剂用柱层析色谱分离产物，得衍生物Ⅰ21.521 g，产率71%。

1.2.2.3 6-氯-2,3-二氢吡咯并[2,1-b]喹唑啉-9(1H)-酮(Ⅰ3)的合成

将1.73 g(10 mmol)2-氨基-4-氯苯甲酸、1.14 mL(11 mmol)2-吡咯烷酮和6 mL三氯氧磷依次加入到100 mL带搅拌器的圆底烧瓶中，100 ℃无水条件下回流1 h；自然冷却后，将反应物倾入碎冰中，用碳酸氢钾溶液调节体系pH值至8，用100 mL二氯甲烷萃取3次，减压旋蒸除去溶剂；用DMF/H2O混合溶剂重结晶，得衍生物Ⅰ31.652 g，产率75%。

1.2.2.4 3-氯-7,8,9,10-四氢氮杂并[2,1-b]喹唑啉-12(6H)-酮(Ⅰ4)的合成

将1.73 g(10 mmol)2-氨基-4-氯苯甲酸、1.695 g(15 mmol)己内酰胺和6 mL三氯氧磷依次加入到100 mL带搅拌器的圆底烧瓶中，100 ℃无水条件下回流1 h；自然冷却后，将反应物倾入碎冰中，用碳酸氢钾溶液调节体系pH值至8，用100 mL二氯甲烷萃取3次，减压旋蒸除去溶剂；以二氯甲烷为洗脱剂用柱层析色谱分离产物，得衍生物Ⅰ41.814 g，产率73%。

1.2.2.5 3-(4-(二甲胺基)亚苄基)-2,3-二氢吡咯并[2,1-b]喹唑啉-9(1H)-酮(Ⅱ1)的合成

将186 mg(1 mmol)衍生物Ⅰ1、195 mg (1.3 mmol)对二甲胺基苯甲醛、5颗活化的3A分子筛和5 mL无水冰醋酸依次加入到100 mL带搅拌器的圆底烧瓶中，120 ℃无水条件下回流8 h；自然冷却后，减压旋蒸除去溶剂；用环己烷重结晶，得衍生物Ⅱ1146 mg，产率46%。

1.2.2.6 6-(4-(二甲胺基)亚苄基)-7,8,9,10-四氢氮杂并[2,1-b]喹唑啉-12(6H)-酮(Ⅱ2)的合成

将214 mg(1 mmol)衍生物Ⅰ2、195 mg(1.3 mmol)对二甲胺基苯甲醛、5颗活化的3A分子筛和5 mL无水冰醋酸依次加入到100 mL带搅拌器的圆底烧瓶中，120 ℃无水条件下回流8 h；自然冷却后，减压旋蒸除去溶剂；用环己烷重结晶，得衍生物Ⅱ2177.1 mg，产率51%。

1.2.2.7 6-氯-3-(4-(二甲胺基)亚苄基)-2,3-二氢吡咯并[2,1-b]喹唑啉-9(1H)-酮(Ⅱ3)的合成

将221 mg(1 mmol)衍生物Ⅰ3、195 mg(1.3 mmol)对二甲胺基苯甲醛、5颗活化的3A分子筛和5 mL无水冰醋酸依次加入到100 mL带搅拌器的圆底烧瓶中，120 ℃无水条件下回流8 h；自然冷却后，减压旋蒸除去溶剂；用环己烷重结晶，得衍生物Ⅱ3172 mg，产率49%。

1.2.2.8 3-氯-6-(4-(二甲胺基)亚苄基)-7,8,9,10-四氢氮杂并[2,1-b]喹唑啉-12(6H)-酮(Ⅱ4)的合成

将249 mg(1 mmol)衍生物Ⅰ4、195 mg(1.3 mmol)对二甲胺基苯甲醛、5颗活化的3A分子筛和5 mL无水冰醋酸依次加入到100 mL带搅拌器的圆底烧瓶中，120 ℃无水条件下回流8 h；自然冷却后，减压旋蒸除去溶剂；用环己烷重结晶，得衍生物Ⅱ4206.5 mg，产率54%。

2 结果与讨论

2.1 虚拟筛选结果

对接结果表明，苯基和氮原子是获得既能与靶点中心催化位点又能与外周活性位点相互作用的化合物的关键。利用MOE设计了一系列不同取代基的脱氧鸭嘴花碱酮衍生物Ⅰ1～Ⅰ4、Ⅱ1～Ⅱ4。虚拟筛选结果显示，所有衍生物的ASE评分(表1)均低于先导化合物脱氧鸭嘴花碱酮，特别是具有二甲胺基苄基取代的衍生物Ⅱ。ASE评分越低，相互作用越强。

表1 脱氧鸭嘴花碱酮衍生物的ASE评分

分子对接和相互作用分析结果显示，所有衍生物都与TcAChE中的多活性位点相互作用。当衍生物Ⅱ4同时与酶中心催化位点和外周活性位点结合时，MOE对接结果最好。对接模型(图4)表明，衍生物Ⅱ4的苯环D与Phe284的苯基通过经典的平行π-π积累相互作用，带正电荷的氮原子与疏水位点Trp279的苯基通过阳离子-π效应相互作用，苯基穿过活性口袋底部的催化位置，通过π-π效应与Tyr70相互作用。相比之下，衍生物Ⅰ4的亚胺基氮原子通过水分子与Asp285和Ser286连接；此外，环A通过Trp279的苯基与酶的外周活性位点相互作用。显然，具有二甲胺基苄基取代的衍生物Ⅱ与酶的结合优于没有取代的衍生物Ⅰ。

衍生物Ⅰ4与TcAChE的对接模型 衍生物Ⅱ4与TcAChE的对接模型

2.2 脱氧鸭嘴花碱酮衍生物的表征

采用Bruker 500型傅立叶变换超导核磁共振仪对脱氧鸭嘴花碱酮衍生物Ⅰ1～Ⅰ4、Ⅱ1～Ⅱ4进行结构表征，结果如下：

衍生物Ⅰ1:1HNMR(CDCl3,500 Hz),δ:2.236～2.321(m,2H,CH2-CH2-CH2),3.140～3.199(m,2H,N=C-CH2-CH2),4.169～4.226(d,2H,CH2-CH2-N),7.302～7.727(m,3H,Ar-H),8.237～8.280(s,1H,O=C-C=CH)。

衍生物Ⅰ2:1HNMR(CDCl3,500 Hz),δ:2.197～2.258(m,6H,N-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C),3.088～3.120(t,2H,N=C-CH2-CH2),4.109～4.138(t,2H,CH2-CH2-N),7.596～7. 633(s,3H, Ar-H),8.103～8.120(s,1H,O=C-C=CH)。

衍生物Ⅰ3:1HNMR(CDCl3,500 Hz),δ:1.734～1.824(m,2H,CH2-CH2-CH2),2.984～3.006(t,2H,N=C-CH2-CH2),4.308～4.325(t,2H,CH2-CH2-N),7.208～7. 373(d,1H,Cl-C=CH-CH),7.617～7. 935(s,1H,Cl-C=CH-C-N),8.166～8.184(s,1H,O=C-C=CH)。

衍生物Ⅰ4:1HNMR(CDCl3,500 Hz),δ:1.577～2.401(m,6H,N-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C),3.116～3.148(t,2H,N=C-CH2-CH2),4.288～4.306(t,2H,CH2-CH2-N),7.289～7. 310(s,1H,Cl-C=CH-CH),7.515～7. 519(s,1H,Cl-C=CH-C-N),8.084～8.101(s,1H,O=C-C=CH)。

衍生物Ⅱ1:1HNMR(DMSO,500 Hz),δ:2.636～2.712(m,2H,CH2-CH2-C),3.036～3.060(s,6H,N-CH3),3.414～3. 4.31(t,2H,O=C-N-CH2-CH2),6.345(s,1H,C-C=C(H)-Ar-N),6.772～6.781(d,2H,H-o-Ar-N),7.457～7. 498(d,1H,HC=CH-CH),7.457～7.610(d,1H,CH=CH-C-N),7.629(d,2H,H-m-Ar-N),7.899～8.002(d,1H,O=C-C=CH)。

衍生物Ⅱ2:1HNMR(DMSO,500 Hz),δ:1.686～1.778(m,6H,N-CH2-CH2-CH2-CH2-C),3.036～3.060(s,6H,N-CH3),4.321～4.344(t,2H,O=C-N-CH2-CH2),6.356(s,1H,C=C(H)-Ar-N),6.775～6.812(d,2H,H-o-Ar-N),7.457～7.498(d,1H,HC=CH-CH),7.457～7.610(d,1H,CH=CH-C-N),7.629(d,2H,H-m-Ar-N),7.899～8.002(d,1H,O=C-C=CH)。

衍生物Ⅱ3:1HNMR(DMSO,500 Hz),δ:2.633～2.708(m,2H,CH2-CH2-C),3.016～3.021(s,6H,N-CH3),4.282～4.315(s,2H,O=C-N-CH2-CH2),6.356(s,1H,C=C(H)-Ar-N),6.776～6.782(d,2H,H-o-Ar-N),7.521(d,1H,Cl-C=CH-CH),7.542(s,1H,Cl-C=CH-C-N),7.636(d,2H,H-m-Ar-N),7.939～8.005(d,1H,O=C-C=CH)。

衍生物Ⅱ4:1HNMR(DMSO,500 Hz),δ:1.722～1.856(m,6H,N-CH2-CH2-CH2-CH2-C),3.006～3.022(s,6H,N-CH3),4.268～4.328(s,2H,O=C-N-CH2-CH2),6.356(s,1H,C=C(H)-Ar-N),6.742(d,2H,H-o-Ar-N),7.516(d,1H,Cl-C=CH-CH),7.534(s,1H,Cl-C=CH-C-N),7.629(d,2H,H-m-Ar-N),7.899～8.002(d,1H,O=C-C=CH)。

2.3 脱氧鸭嘴花碱酮衍生物对乙酰胆碱酯酶的体外抑制活性

以上市药物加兰他敏为阳性对照，采用埃尔曼方法[22]测定脱氧鸭嘴花碱酮衍生物对乙酰胆碱酯酶的体外抑制活性，结果见表2。

表2 脱氧鸭嘴花碱酮衍生物对乙酰胆碱酯酶的体外抑制活性

由表2可知，与阳性对照加兰他敏相比，脱氧鸭嘴花碱酮衍生物对乙酰胆碱酯酶均表现出不同程度的体外抑制活性，且衍生物Ⅱ的体外抑制活性比相应衍生物Ⅰ的高；脱氧鸭嘴花碱酮衍生物对乙酰胆碱酯酶的体外抑制活性测定值与计算机辅助设计预测值基本一致；体外抑制活性最高的衍生物Ⅱ4的IC50值达到2.03 μmol· L-1，其体外抑制活性约为阳性对照加兰他敏的2倍。

2.4 讨论

对对接结果和体外抑制活性进行了分析和比较：

首先，由于对二甲胺基苯甲醛片段的取代，衍生物Ⅱ的体外预测和检测数据均表现出比衍生物Ⅰ更强的抑制活性。这一发现在衍生物与加利福尼亚电鳐乙酰胆碱酯酶的对接模型中很明显：衍生物Ⅱ4的苯环D通过经典的平行π-π积累与Phe284的苯基相互作用，带正电荷的氮原子通过阳离子-π效应与疏水位点Trp279的苯基同时相互作用，苯基通过π-π效应与Tyr70相互作用。

其次，含氯取代基(R=Cl)的衍生物的体外抑制活性强于没有取代基(R=H)的衍生物。这可能是由于：一是氯原子可能延长了分子的长度，使配体和受体之间的结合合理化；二是氯取代基的亲电特性使其更容易与乙酰胆碱酯酶中的极性残基相互作用。

最后，五元和七元杂环衍生物表现出不同的体外抑制活性，七元杂环衍生物具有较高的体外抑制活性，这可能是由于在对接时识别活性位点的偏差。从化学结构上看，七元杂环衍生物的平面结构比五元杂环衍生物的平面结构更好，可能使其与真实酶的结构匹配得更好。

3 结论

设计并合成了脱氧鸭嘴花碱酮衍生物，其IC50值在毫摩尔到微摩尔浓度范围内，对乙酰胆碱酯酶有明显的体外抑制活性；其中体外抑制活性最高的衍生物Ⅱ4的IC50值仅为2.03 μmol·L-1，其体外抑制活性约为阳性对照加兰他敏的2倍，在治疗AD方面具有潜力。ASE评分的高低与衍生物抑制活性的高低不完全一致，但总体上表现出一致的倾向。