全国多中心血流分离近平滑念珠菌药物敏感性和分子流行病学回顾性研究

张丽 于淑颖,3 宁雅婷,3 肖盟 肖玉玲 崔兰英 陈中举 严岩 叶丽艳 徐英春

(1. 中国医学科学院北京协和医院检验科，北京 100730； 2. 侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室，北京 100730； 3. 中国医学科学院北京协和医学院，北京 100730； 4. 四川大学华西医院实验医学科，成都 610041； 5. 哈尔滨医科大学附属第一医院检验科，哈尔滨 150001； 6. 华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科，武汉 430030； 7. 北京大学第一医院检验科，北京 100034； 8. 解放军总医院第一医学中心医学检验中心，北京 100853)

念珠菌血症是侵袭性真菌病的重要感染类型，随着免疫抑制患者的增加，念珠菌血症的发病率和病死率也呈上升趋势[1-2]。白念珠菌是引起念珠菌血症最常见的病原体，但是近年来非白念珠菌如热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌分离率越来越高，其中近平滑念珠菌成为念珠菌血症第2常见病原体[3-5]。近平滑念珠菌可在导管和其他植入物中形成生物膜，在医院环境中长期存在难以清除，据报道是引起院内传播流行的重要真菌[6-8]。但目前关于中国血流感染的近平滑念珠菌分子流行病学的研究和报道非常匮乏。

中国侵袭性真菌耐药监测网(China Hospital Invasive Fungal Surveillance Net，CHIF-NET)是北京协和医院微生物专业组在2009年正式牵头启动的全国性真菌耐药监测项目[9]。本研究基于CHIF-NET 10～13全国多中心收集的血流感染的近平滑念珠菌，展开分子流行病学回顾性研究。传统的分子生物学分型方法如多位点序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)、扩增片段长度多态性分型(Amplified fragment length polymorphism, AFLP)等方法因在近平滑念珠菌中分辨率低而不适用[10]。近年来Sabino等[11-12]建立的基于4个位点的微卫星分型方法被广泛用于近平滑念珠菌的分型和暴发研究。因此，本研究将采用微卫星分型方法对血流感染近平滑念珠菌进行分子流行病学研究，并联合菌株药物敏感结果，回顾性分析血流感染近平滑念珠菌在中国的流行情况及与耐药情况的关联。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

本研究纳入CHIF-NET项目中自血流感染患者分离的377株非重复近平滑念珠菌，共分离自42家医院(编号为H01～H42)，地区分布为：华东地区18家医院，东北地区6家医院，华北地区4家医院，华中地区4家医院，西南地区3家医院，华南地区3家医院，西北地区4家医院。

1.2 培养基

菌株首次传代使用科马嘉显色培养基(CHROM Agar，法国)，然后采用沙堡弱培养基(Oxoid，英国)再次传代后进行复核鉴定、药敏试验和微卫星分型。

1.3 方法

菌株鉴定 所有菌株采用rRNA内转录间隔区(ITS)序列测定联合MALDI-TOF MS质谱进行复核鉴定[13]。

药物敏感性试验 纸片扩散法操作按照CLSI M44-A2文件的规定检测氟康唑和伏立康唑的药物敏感性，判定折点参考CLSI M60文件，具体如下：氟康唑，敏感(susceptible, S)≥17 mm，剂量依赖性敏感(susceptible-dose dependent，SDD)14～16 mm，耐药(resistant，R)≤13 mm；伏立康唑，S≥15 mm，中介(intermediate，I)13～14 mm，R≤12 mm，纸片扩散法药敏试验的质控菌株为近平滑念珠菌ATCC22019和克柔念珠菌ATCC6258[14-15]。

微卫星分型 采用Sabino等[11]描述的4个高度多态性的微卫星位点，即B5、CP1、CP4和CP6，对近平滑念珠菌进行基因分型，其中B5和CP4正向引物用6-羧基荧光素标记，CP1和CP6正向引物用六氯荧光素进行标记。使用4对荧光标记的引物对提取的DNA进行扩增，然后用ABI 3730XL DNA分析仪(Applied Biosystems, 美国)和GeneMarker v1.8软件(SoftGenetics LLC,美国)对扩增产物进行毛细管电泳测定和结果分析。

2 结 果

2.1 近平滑念珠菌血流感染患者性别、年龄和科室分布

表1显示377例近平滑念珠菌血流感染患者在不同地区的分布及性别、年龄和科室分布。其中男性258例(68.4%)，女性119例(31.6%)。按照年龄区间分析，0～5岁32例(8.5%)，5～20岁14例(3.7%)；21～40岁48例(12.7%)，41～60岁109例(28.9%)，61～80岁137例(36.3%)，>80岁37例(9.8%)。按照科室分布分析，内科患者90例(23.9%)，外科患者100例(26.5%)，儿科患者13例(3.4%)，综合ICU患者82例(21.8%)，外科ICU患者47例(12.5%)，新生儿ICU患者13例(3.4%)，门急诊患者18例(4.8%)，其他科室患者14例(3.7%)。

表1 根据性别、年龄和病房分组后患者数量分布Tab.1 Dstribution of patients according to genders, ages and wards 例

2.2 近平滑念珠菌体外抗真菌药物敏感性

377株近平滑念珠菌中，24株对氟康唑耐药(6.4%)，3株菌对氟康唑为剂量依赖性敏感(0.8%)。10株(2.7%)对伏立康唑耐药(该10株菌均亦对氟康唑耐药)，4株对伏立康唑为中介(1.1%)。3株对氟康唑为剂量依赖性敏感的菌株分布于东北(1株)、华北(1株)和华中(1株)；4株对伏立康唑中介的菌株分布于华北(1株)、西南(1株)和华中(2株)。氟康唑和伏立康唑耐药菌株在不同地区的数量分布详见表2。可以看出，耐药菌株的分布相对集中出现在个别医院，如华北地区8株氟康唑耐药株均出现在H26医院内，华中地区有4株均来源于H06医院。

表2 氟康唑和伏立康唑耐药菌株在不同地区的数量分布Tab.2 Distribution of fluconazole or voriconazole resistant isolates in different districts

2.3 近平滑念珠菌微卫星分型结果

所有377株近平滑念珠菌使用微卫星分型方法分为172个微卫星型别(microsatellite genotype，MT)，命名为MT1～MT172。不同地区的型别数量/菌株数量为：华东，71个MT型别/128株菌；东北，39个MT型别/60株菌；华北，30个MT型别/56株菌；华中，33个MT型别/54株菌；西南，25个MT型别/42株菌；华南，20个MT型别/29株菌；西北，8个MT型别/8株菌。四个微卫星位点扩增长度多态性和各自分辨率分别为：B5(38，22.1%)，CP1(27，15.7%)，CP4(84，48.8%)，CP6(86，50%)。

172种MT型别中，125个MT型别各自仅在单个菌株中出现，其余47个MT型别包含至少2株菌(分布于同家医院或不同医院)。我们统计了同一家医院内同型别菌株出现在2例或以上不同患者的情况，28家医院内共有65个，涉及169例患者，其中同型别氟康唑敏感株在同家医院感染不同患者的情况存在59个，同家医院同型别氟康唑敏感株感染3例及以上患者的情况(同家医院同型别仅感染2个不同患者的细节未列举)见表3；同型别的氟康唑耐药株在同家医院内感染不同患者的情况有6种(见表4)。表3和表4可以看出，同型别菌株感染院内不同患者的情况主要见于医院的综合ICU病房、外科病房和外科ICU病房，同型别菌株分离相隔时间从19～1047 d不等。MT46、MT11和MT114型别菌株在多家医院出现感染不同患者的情况。

表3 同家医院同MT型别菌株(氟康唑敏感)感染≥3个不同患者的情况Tab.3 Distribution of fluconazole susceptible isolates with the same MT type infecting more than three patients in the same hospital

同家医院内同型别氟康唑耐药菌株感染不同患者的情况见表4，同型别的菌株耐药表型表现一致，如华北H26医院内4株MT26菌株均表现为氟康唑耐药而伏立康唑敏感，其中3株分离于外科ICU，1株分离于外科病房；华东H06医院内4株MT16型别菌株表现为氟康唑和伏立康唑均耐药，4株菌分别在院内综合ICU、儿科和内科分离所得。同家医院内同型别耐药菌株分离相隔时间范围在27～728 d。

表3和表4中所涉及的MT型别微卫星位点扩增长度见表5。近平滑念珠菌为双倍体，因此每个位点扩增后包含两个等位基因的长度。

表4 同家医院内同MT型别氟康唑耐药菌株分离于不同患者情况Tab.4 Distribution of fluconazole resistant isolates with the same MT type infecting different patients in the same hospital

表5 部分MT型别微卫星位点扩增长度Tab.5 The length of microsatellite alleles for some MT types

3 讨 论

近平滑念珠菌是我国引起念珠菌血流感染第2常见的病原体[16]。本研究基于CHIF-NET项目对全国多中心收集的血流感染的近平滑念珠菌进行流行病学分析。发现国内近平滑念珠菌血流感染在老年人中更常见，其中60岁以上患者174例，占总人数46.2%。我国目前正在逐渐进入老龄化社会，同时随着免疫抑制剂等广泛使用，需要警惕念珠菌血流感染的发生。从病房分布来看，感染患者主要分布于内科病房、外科病房、外科ICU和综合ICU病房。药物敏感性试验结果显示血流感染近平滑念珠菌对氟康唑和伏立康唑的耐药率分别为6.4%和2.7%，本研究与全球SENTRY真菌监测项目连续20年的监测数据显示的近平滑念珠菌氟康唑的耐药率(2.5%～5.5%)接近[17]。本研究中氟康唑耐药株中41.6%的菌株对伏立康唑交叉耐药，这与念珠菌唑类耐药机制不同类型相关，据报道由唑类药物作用靶酶编码基因ERG11发生突变导致的唑类耐药易表现为氟康唑和伏立康唑交叉耐药[18]。

对377株近平滑念珠菌进行微卫星分型后共分为172个型别，多数型别为散发，分布于不同的地区，但是28个医院内存在同型别近平滑念珠菌感染不同患者的情况。有文献报道同家医院同种型别菌株致不同患者感染称为1个聚簇(a cluster)，短时间内同病房内不同患者分离出同型别菌株，提示存在院内菌株克隆传播较大可能性；已有研究证实近平滑念珠菌可在院内不同患者间水平传播，甚至引起院内感染暴发[6, 19-20]。本研究结果提示可能发生克隆传播的型别主要分布在内科病房、外科病房和外科ICU，有报道近平滑念珠菌可因手术、器械定植、导管护理等操作通过医护人员的手在患者间传播[12,21]。另外部分同病房同型别菌株分离相隔时间较长，已有研究提示近平滑念珠菌可在医院环境中长期存在难以去除，可成为住院患者血流感染的感染源[19,22-23]。

目前唑类药物是治疗近平滑念珠菌感染的一线药物，因此本研究仅重点关注了该菌对于氟康唑和伏立康唑的药物敏感性。本研究发现同家医院内同型别氟康唑耐药菌株分离于不同患者，提示近平滑念珠菌耐药株也可能存在院内传播，主要发生在外科病房、外科ICU和综合ICU病房。国际上如巴西和印度等已有关于近平滑念珠菌耐药株暴发流行的报道[24-25]。有学者报道在肝移植患者念珠菌感染中，耐药株比敏感株的致病力更强[26]。尽管目前近平滑念珠菌对唑类药物耐药率不高，但是耐药株在医院内传播可导致耐药率升高[17]。本研究中华北地区H26医院内两个型别耐药菌株的聚簇导致华北地区氟康唑耐药率高于其他地区，我们应该关注念珠菌院内传播问题，尤其是耐药菌株的传播问题。

本研究针对血流感染近平滑念珠菌的流行病学分析发现，近平滑念珠菌血流感染在老年患者中更常见，需要警惕人口老龄化导致的真菌感染发生率增加。另外，近平滑念珠菌感染存在院内传播现象，需要警惕暴发流行可能，医护人员和院感人员需要提高对真菌院内感染和传播的认识并加强防控，实验室需提高真菌检测能力[27]。我国已在2019年建立全国真菌病监测网[“国家卫生健康委办公厅关于建立全国真菌病监测网的通知”，国卫办医函〔2019〕481号]，未来还将制定针对真菌感染感控的具体防控措施。本研究也将为国家相关防控政策的制定提供重要的基础研究数据。

致 谢

感谢全国真菌耐药监测网(CHIF-NET)2010-13项目的所有参加单位。