不同产膜能力的念珠菌对妊娠期阴道炎患者Toll 样受体通路及妊娠结局的影响

李彩云 柯婷婷 李刚 赵梅 王文

(1.江苏省人民医院浦口分院检验科，南京 211800；2.宁夏医科大学总医院医学实验中心，银川 750000)

妊娠期产妇阴道酸碱平衡失调，大大增加了感染的风险[1]。大量研究表明，阴道微环境的变化可能跟不良妊娠结局有关。念珠菌是引起妊娠期阴道炎最常见的致病菌之一[2]，当念珠菌形成生物被膜以后,其耐药性将上升10～1000倍，并且还能逃脱人体免疫系统的攻击，引起患者机体长期感染[3]。正常情况下，机体通过识别不同致病菌的相关分子模式(PAMPs)来引起一系列免疫反应而将其杀死，但生物被膜形成以后能把这些成分包裹起来，引发免疫逃逸[4]，因此，生物被膜型念珠菌引起的感染对临床医生产生了很大的困扰。本文旨在通过研究分析不同产膜能力的念珠菌与感染患者机体Toll样受体信号通路的免疫关系，探讨念珠菌生物膜在妊娠期阴道炎感染患者体内的免疫逃逸机制，找到能够有效清除生物膜的方法，并且研究探讨其对不良妊娠结局的影响，从而为临床产科治疗念珠菌引起的阴道炎提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 菌株及标本

收集2016年1月—2019年12月从我院产科阴道分泌物标本中分离出的念珠菌178株，采用法国梅里埃公司全自动微生物分析仪(VITEK 2 COMPACT)将微生物鉴定到种。同时收集上述患者的外周静脉血5 mL置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中备用，再收集178例同时期阴道分泌物中未检出念珠菌的健康产妇的外周血作为对照。

1.2 试剂与仪器

TRI zol、RNA反转录试剂盒、YPD液体培养基、ELISA试剂盒、血清总蛋白提取试剂盒、基因引物由上海生工生物工程有限公司合成；二氧化碳培养箱、酶标仪、96孔细胞培养板、荧光定量PCR仪、离心机等。

1.3 念珠菌生物膜形成能力分析

把分离出的菌株用RPMI1640培养基调整浓度为1.0×106/mL左右，然后加入到96孔细胞培养板，对照组加入等量的培养基，37℃培养24 h以后，PBS冲洗3遍，用戊二醛固定后加入染液结晶紫，等待30 min后，用水冲洗，吸光度值用酶标仪检测。结果判断A570>0.5为强产膜菌，A570<0.25为弱产膜菌，在两者之间为中等产膜菌。加入荧光染料FITC-conA后，用荧光显微镜观察各组菌株的形态特征。

1.4 RT-PCR检测各组妊娠期阴道炎患者外周血单个核细胞中TLR2、TLR4、MyD88基因的表达量

采集各组妊娠期阴道炎患者外周静脉血，利用Ficoll密度梯度离心法收集单个核细胞，提取总RNA，反转录，测定基因TLR2、TLR4、MyD88mRNA表达水平，然后以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔct相对定量计算方法分析表达量的变化(引物序列见表1)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.5 ELISA测定各组妊娠期阴道炎感染患者细胞因子的分泌情况

收集各组患者血液标本，离心后，取上层血浆待用，按照ELISA试剂盒使用说明方法测定各组血浆中的炎症因子IFN-γ、IL-4、IL-1β、TNF的表达量。

1.6 诊断并记录各组妊娠期阴道炎感染患者妊娠不良结局的情况

早产、羊水异常、新生儿窒息、产褥感染、新生儿黄疸、绒毛膜羊膜炎的诊断标准均参照《妇产科学》教材。

1.7 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析，组间比较用单因素方差分析，计数资料用百分率表示，组间比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 念珠菌生物膜的表型分类

本实验将178株从妊娠期阴道炎患者分离出的念珠菌分为强产膜组64株、中等产膜45株、弱产膜69株(非产膜组)。用结晶紫和FITC-conA染色后观察菌株形态，发现强产膜菌大部分以菌丝的形态相互交错密密麻麻排列，非产膜菌大部分以酵母样的形态附着于培养皿的底部(见图1)。

图1 结晶紫和FITC-conA染色后的菌株形态Fig.1 Strain morphology after staining with crystal violet and FITC-conA

2.2 RT-PCR法检测各组妊娠期阴道炎感染患者外周血单个核细胞中TLR2、TLR4、MyD88基因的表达量

比较患者感染念珠菌后，其机体对强产膜菌与非产膜菌的免疫应答能力，结果发现分离出强产膜菌患者TLR2、TLR4、MyD88基因的表达量比对照组低，非产膜组比对照组高，差异有统计学意义 (P<0.05，见图2)。

图2 RT-PCR法检测各组妊娠期阴道炎感染患者外周血单个核细胞中TLR2、TLR4、MyD88基因的表达量Fig.2 Detection of TLR2, TLR4, MyD88 gene expression in peripheral blood mononuclear cells of patients with vaginitis infection during pregnancy by RT-PCR method

2.3 ELISA测定各组妊娠期阴道炎感染患者细胞因子的分泌情况

结果发现感染强产膜菌的妊娠期阴道炎患者血浆中IL-1β、TNF、IFN-γ浓度与对照组相比有所下降，非产膜组与健康对照组相比有所上升，差异有统计学意义(P<0.05)；而细胞因子IL-4的浓度，与对照组相比，强产膜组明显升高，而非产膜组差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 ELISA测定各组细胞因子的浓度Tab.2 ELISA to determine the concentration of cytokines in each group

2.4 各组妊娠期阴道炎感染患者妊娠结局的比较

对照组不良妊娠结局发生率为2.8%，非产膜组不良妊娠结局为 4.3%，与对照组相比差异没有统计学意义(P>0.05)；强产膜组不良妊娠结局为 21.8%，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组妊娠期阴道炎感染患者妊娠结局的比较Tab.3 Comparison of pregnancy outcomes of patients with vaginitis infection during pregnancy in different groups

3 讨 论

妊娠期女性阴道微环境发生改变，免疫力下降，容易引发致病菌感染，目前发现阴道炎可能妊娠不良结局有关[5]，念珠菌是引起阴道炎最常见的病原菌，严重者可引起流产、胎膜早破等不良后果。生物膜型的念珠菌形成以后，其致病性更强，目前对于妊娠期阴道炎患者还没有很好的治疗方法。

有研究报道，念珠菌生物膜形成能力的强弱与其致病性有关[6]。本实验将从妊娠期阴道炎患者分离出的菌株分为强产膜组和非生物膜组，用荧光显微镜观察期形态，发现强产膜菌呈菌丝状相互交错密集排列，而弱产膜菌大部分以酵母样黏附于培养板底部，其生物学结构可能也是其具有强耐药性和强抵抗性的原因之一。

机体的固有免疫应答是抵抗感染的第1道防线，主要通过模式识别受体来识别外源性物质，从而激活一系列信号传导系统，发挥免疫防御功能[7]。Toll样受体是表达于细胞膜上以及内膜系统上的常见模式识别受体，其主要通过胞外富含亮氨酸的结构域直接识别病原菌的分子结构，激活细胞内的信号传导通路，引起炎症因子的变化，达到抵抗病原菌的目的[8]。研究发现TLR2、TLR4在感染引起的免疫应答中发挥着重要的作用，通过显著表达后识别念珠菌表面的糖磷脂甘露聚糖, 通过MyD88依赖性途径和MyD88非依赖性途径来激活NF-κB和丝裂原蛋白激酶级联反应通路,引起大量炎性细胞因子的变化来发挥免疫应答作用[9]，本实验通过RT-PCR法检测发现，强产膜组TLR2、TLR4、MyD88基因的表达量低于对照组，而非生物膜组表达量高于对照组，说明感染强产膜菌株的患者机体能够通过降低TLR2、TLR4受体的表达和抑制MyD88依赖性途径而降低固有免疫应答能力，非生物膜组病原菌主要通过增强Toll受体的表达启动免疫应答。这与杨婧等[10]报道的浮游状态的铜绿假单胞菌通过高表达TLR4，激活p38MAPK和NF-κB信号传导通路，引起的炎症反应相一致，其所报道的生物膜型铜绿假单胞菌更主要是通过分泌藻酸盐抑制中性粒细胞、巨噬细胞的吞噬而引起免疫逃逸。本实验又进一步测定各组阴道炎患者细胞因子的分泌情况，发现感染强产膜组患者血浆中IL-1β、TNF、IFN-γ浓度与对照组相比明显降低，非生物膜的患者血浆中的浓度与对照组相比明显升高，差异有统计学意义。强产膜组患者IL-4因子浓度明显高于对照组，这说明强产膜能够扰乱机体的免疫功能，Th1型主要以IL-1β、TNF、IFN-γ分泌为主，介导细胞免疫[11]，Th2型主要以IL-4分泌为主，刺激机体产生抗体，介导体液免疫[12]。而且IL-4为炎症抑制因子，主要的生物学作用是抑制巨噬细胞的活性，局部控制炎症反应。本研究显示，强产膜菌诱发机体主要产生Th2型免疫反应，使得Th1/Th2比例失调，从而引起细胞因子表达量的变化,这可能是强产膜菌相对非产膜菌更容易发生免疫逃逸，引起机体慢性感染的原因之一。因此，这时可考虑通过调节患者机体免疫反应类型，增加Th1型免疫反应，来清除感染的病原菌，通过适当抑制Th2型免疫反应来降低机体的炎症反应。

本研究进一步分析了不同状态的念珠菌对妊娠结局的影响，结果显示对照组不良妊娠结局发生率为2.8%，强产膜组不良妊娠结局为 21.8%，差异有统计学意义，说明强产膜念珠菌对妊娠期阴道炎患者影响较大，在临床工作中因进行适当宣传教育，必要时在医生的指导下进行积极治疗。

强产膜念珠菌对母婴影响很大，其相对非产膜菌而言，更容易发生免疫逃逸，引起感染的慢性化。因此，应鼓励产妇及早到医院产检，及时干预治疗，预防不良结局的发生。