外阴阴道念珠菌病患者血清及分泌物HMGB1、IL-17、IL-23表达水平及临床意义

高爱莉 代歆悦 李华平 王焕丽 马少吟 陈教全 朱慧兰

(广州市皮肤病防治所，广州 510095)

外阴阴道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是一种常见的皮肤黏膜疾病，据统计，有10%～15%的妇女患无症状型VVC，75%的育龄期妇女至少经历1次VVC，40%～50%的妇女患病2次及以上[1]。复发性外阴阴道念珠菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC)指 12个月中确实发作4次或4次以上有症状的VVC，约8%的成年妇女患有RVVC[2]。VVC的临床症状呈非特异性，主要表现为外阴瘙痒，外阴和阴道红斑、水肿和皲裂，部分患者伴有阴道酸痛和刺激，严重者有明显的排尿困难。重度 VVC 是指临床症状严重，外阴或阴道皮肤黏膜有破损，按 VVC 评分标准[3]，评分≥7分者(见表1)。VVC的发作与复发给人们身心带来不良影响。

文献显示VVC患者中大量细胞因子表达异常[4-5]，多项研究也证实了白细胞介-17(interleukin-17，IL-17)和白细胞介-23(IL-23)等细胞因子在阴道念珠菌中具有重要的免疫保护作用[6-8]。而高迁移率族蛋白 1(high mobility group box-1，HMGB1)是高迁移率族蛋白中的一员，既往研究认为HMGB1是一种重要的内源性信号分子，在DNA结构和转录调控中起着重要的作用。近年来发现，HMGB1是一种晚期炎症介质，可由免细胞和坏死受损细胞释放至细胞外，随后迁移至炎症部位结合相应受体，如TLR4、RAGE等，诱导细胞因子产生、趋化，促进晚期炎症[9]。VVC是一种真菌感染引起的炎症性疾病，而HMGB1与VVC发病关系暂未见有相关报道。

表1 VVC临床症状评分Tab.1 The clinical symptom scores of VVC

本研究旨在于探讨IL-17、IL-23 及 HMGB1 在 VVC 患者血清及阴道分泌物中的表达情况，以及三者表达与 VVC临床指标之间的关系，试图阐明其在VVC发病机制中的作用，为寻找新的治疗靶点提供一定理论依据。

1 临床资料

1.1 资料

选择2016年12月至2018年12月广州市皮肤病防治所门诊就诊的年龄为18～50岁性活跃期妇女。常规询问病史及妇科检查, 对临床怀疑外阴阴道念珠菌病的患者, 取其阴道分泌物做真菌镜检和培养鉴定。以真菌镜检有假菌丝且培养鉴定为白念珠菌的患者作为入选病例，随机选取105例VVC患者，并按照临床症状评分标准分为轻中度VVC组、重度VVC组及RVVC组，选择正常体检者，阴道分泌物检查白细胞阴性，真菌镜检阴性, 培养阴性的39例作为正常对照组。所有患者由主诊医师详细记录主要临床资料，包括：姓名、年龄、病程、临床症状评分、1个月内是否使用过激素治疗、1个月内是否使用过抗生素治疗、1个月内是否服用过避孕药、是否使用宫内节育器、是否妊娠、糖尿病及血糖控制情况、1个月内是否使用免疫抑制药物等。排除标准：①有自身免疫性或免疫缺陷疾病者; ②妊娠或合并其他生殖器感染性疾病者; ③有特殊药物服用史者; ④1周内阴道给药和阴道灌洗者。

1.2 方法

标本采集及处理 ①外周血标本采集：采集所有受试者清晨空腹状态下静脉血5 mL，离心分离血清，-80℃保存备用。②阴道分泌物采集：所有受试者取材时均常规消毒外阴, 将统一标准的专用干棉签置于阴道后穹窿处留置30 s，取出后，一份棉拭子进行真菌涂片及培养，另一份棉拭子放入有1 mL无菌磷酸盐缓冲液(PBS)的Eppendor管中，充分转动后取出棉拭子，再将Eppendor管3 000 r/min离心3 min，吸取上清液，储存于-80℃冰箱备用检测。

检测方法 采用 ELISA 检测血清及分泌物中HMGB1(南京建成公司)、IL-17(杭州联科公司)及IL-23(杭州联科公司)及含量，具体操作严格按照试剂盒使用说明进行，并根据试剂盒提供的样本制作标准曲线, 求出标本的浓度。

2 结 果

2.1 一般情况

本研究共纳入VVC患者105例，平均年龄为 (33.4±9.8)岁，其中轻中度VVC组51例、重度VVC组21例、RVVC组33例；对照组39例，平均年龄(31.2±8.8)岁。

2.2 血清及分泌物中HMGB1与IL-17、IL-23检测结果

外周血中，重度VVC组及RVVC组患者HMGB1水平均较正常组高(P<0.05)，轻中度及重度VVC组IL-17水平均高于对照组(P<0.05)。轻中度及重度VVC组、RVVC组IL-23水平均高于对照组(P<0.05)；分泌物中，轻中度及重度VVC组、RVVC组IL-17水平均高于对照组(P<0.05)。轻中度及重度VVC组、RVVC组IL-23水平均高于对照组(P<0.05)见表2～4及图1～3。

表2 各组患者外周血中HMGB1的水平Tab.2 The levels of HMGB1 in peripheral blood

表3 各组患者外周血及阴道分泌物中IL-17的水平Tab.3 The levels of IL-17 in peripheral blood and vaginal discharge

表4 各组患者外周血及阴道分泌物中IL-23的水平Tab.4 The levels of IL-23 in peripheral blood and vaginal discharge

图1 各组患者外周血中HMGB1的水平 图2 各组患者外周血及分泌物中IL-17的水平 图3 各组患者外周血及分泌物中IL-23的水平Fig.1 The levels of HMGB1 in peripheral blood Fig.2 The levels of IL-17 in peripheral blood and vaginal secretions Fig.3 The levels of IL-23 in peripheral blood and vaginal discharge

2.3 HMGB1水平与IL-17表达的相关性分析

研究发现，外周血中HMGB1水平与IL-17、IL-23表达成正相关，差异有统计学意义(P<0.05)，见表5及图4。

表5 外周血中HMGB1水平与IL-17、IL-23表达相关性分析Tab.5 Correlation analysis of the HMGB1 level and IL-17, IL-23 expression in peripheral blood

2.4 IL-23与IL-17表达的相关性分析

对105例VVC患者外周血及分泌物中IL-23水平与IL-17进行了相关分析，结果发现：外周血及分泌物中IL-23的表达水平与IL-17的表达均成正相关，差异有统计学意义(P<0.05)，见表6及图5。

表6 外周血及分泌物中IL-23水平与IL-17相关性分析Tab.6 Correlation analysis of IL-23 and IL-17 in peripheral blood and vaginal discharge

2.5 HMGB1、IL-17、IL-23与疾病严重程度的相关性分析

研究发现，患者外周血中HMGB1水平与疾病严重度成正相关，有统计学意义(P<0.05)；分泌物中IL-17水平与疾病严重度成正相关，差异有统计学意义(P<0.05)，见表7。

表7 IL-17、IL-23及HMGB1水平与VVC疾病严重度相关性分析Tab.7 Correlation analysis of IL-17, IL-23 and HMGB1 with the severity of VVC

图4 HMGB1水平与IL-17、IL-23表达的相关性 图5 IL-23与IL-17表达的相关性Fig.4 Correlation analysis of the HMGB1 level with IL-17, IL-23 expression Fig.5 Correlation analysis of IL-17, IL-23 expression

3 讨 论

念珠菌属于条件致病性双相菌，有酵母相及菌丝相，酵母相通常为无症状寄生状态，当各种诱因导致机体免疫力降低时，念珠菌大量繁殖，并由酵母相则可转化为形成菌丝相，侵袭组织能力增强，导致阴道炎的产生，目前国内外研究普遍认为细胞免疫在念珠菌感染中起主要的抗感染保护作用[10-11]。IL-17是一个常见的促炎因子，它是Th17细胞的效应细胞因子，其分泌受到Th17细胞的分化水平影响，而高表达的IL-23可诱导Th17的分化增多。Kagami等[12]也发现，肠道念珠菌定植患者体内可检测到高表达的IL-17。动物实验发现局部IL-23可能在小鼠阴道念珠菌病的发病机制中起一定作用，在感染过程中具有保护作用[6]。并且在人类阴道念珠菌病中也证实了IL-17、IL-23等细胞因子发挥着重要的免疫保护作用[6-8]。

HMGB1作为一种晚期炎症介质，近年来也发现其在一些感染性及炎症性疾病中发挥作用， Jhun等[13]发现，乙型肝炎患者外周血中HMGB 1水平明显升高，提示HMGB1可能参与感染性疾病和局部炎症反应。另有研究表明，甘草素是HMGB1最常见的抑制剂，其可通过TLR4途径降低IL-23、IL-17等炎性因子表达，减轻心肌缺血/再灌注损伤[14]。而HMGB1是否也参与了VVC的疾病发生，暂未见报道。

据此，我们检测了VVC患者及健康者体内HMGB1、IL-17、IL-23的水平，并分析各指标及其与VVC临床症状指标间的相关性。发现外周血中，重度VVC组及RVVC组患者外周血中HMGB1水平均高于对照组(P<0.05)，轻中度及重度VVC组IL-17水平均高于对照组(P<0.05)，轻中度及重度VVC组、RVVC组IL-23水平均高于对照组(P<0.05)，且HMGB1水平与IL-17、IL-23表达成正相关(P<0.05)，IL-23水平与IL-17表达成正相关(P<0.05)；而分泌物中，轻中度及重度VVC组、RVVC组IL-17水平均高于对照组(P<0.05)，仅轻中度VVC组IL-23水平高于对照组(P<0.05)，IL-23水平与IL-17表达亦成正相关(P<0.05)。由此我们推测：VVC患者体内存在高水平的HGMB1，其可通过结合TLR4受体，促进IL-23诱导的IL-17表达，或直接上调IL-17的表达，可能参与VVC的发病。在该研究中，部分研究组与对照组间差异无统计学意义，如重度VVC组中IL-23与对照组差异无统计学意义，可能与我们收集的病例数较少，后续将进一步进行大样本的检测，并进行统计学分析。

随后，我们分析了天然免疫相关因子与疾病严重程度的关系，研究发现：外周血中，HMGB1水平与疾病严重度成正相关(P<0.05)；分泌物中，IL-17水平与疾病严重度成正相关(P<0.05)。这一结果提示，HMGB1、IL-17的水平一定程度上提示了VVC患者的病情严重程度。说明二者与外阴阴道念珠菌病的发病、病情严重程度有一定的相关性。

综上所述，本研究结果表明，血清及分泌物中 HMGB1、IL-17、IL23 在 VVC 患者中显著高表达，且三者与疾病活动性密切相关，推测三者有望成为VVC治疗和预防的新靶点，值得进一步深入研究探讨。