新生隐球菌SER5基因的敲除与功能验证研究

童双礼 吴洁 李莎莎 桑军军1,

[1.福建医科大学福总临床医学院(第九○○医院)烧伤整形科，福州 350001；2.福建医科大学福总临床医学院皮肤科，福州 350001；3.32231部队卫生所，福州 350001；4.厦门大学附属东方医院，福州 350001]

新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)是一种普遍存在于自然环境中的机会性致病真菌，艾滋病患者等免疫缺陷人群和免疫正常人群都可受累,能引起多种部位的感染，其中以中枢神经系统感染最为常见，预后也最为严重，可引发致命性的脑膜脑炎[1]。根据最新的流行病学研究估计，全球艾滋病患者中每年约有菌感染约278 000例，而感染死亡患者约181 000例[2]。

37℃生长、荚膜、黑色素、尿素酶等是目前已知的新生隐球菌的毒力因子[3]。蛋白酶在维持真菌生理正常功能中扮演着重要的角色[4]。新生隐球菌丝氨酸蛋白酶被认为是隐球菌的潜在毒力因子，但其在隐球菌感染中的作用和地位还未明确[5]。本研究中，我们通过基因敲除获得了丝氨酸蛋白酶家族基因中SER5(CNAG_02494)的基因缺失株，并对其表型和功能进行了初步探究。

1 材料和方法

1.1 材料

实验菌株和引物 本研究中使用的菌株为新生隐球菌格鲁比变种标准菌株H99，质粒为pJL517、pCH233，使用的引物见表1。

表1 本实验中使用的引物Tab.1 Primers used in this study

培养基、实验药品及试剂 YPD液体培养基(1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖)、YPD固体培养基(1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂)、山梨醇培养基(YPD+1 mol/L山梨醇)、选择培养基(YPD+200mg/L G418/Neomycin，YPD+100 mg/L Nourseothricin)、LB(0.5%酵母膏、1%蛋白胨、0.5%氯化钠)、LA(LB+100mg/L Ampicilin)、LK(LB+100 mg/L Kanamycin)、YNB培养基(0.67%酵母基本氮源、2%琼脂)、应激培养基(YPD或YNB加入对应的药剂)、In-Fusion©HD Cloning Kit、High-Fidelity DNA Polymerase、标准培养皿、镊子、玻璃珠、试管、细胞计数器、PBS等。

主要仪器和器材 实验中主要用到的仪器包括Bio-Rad 真空冻干机、Thermo高速离心机、Bio-Rad基因枪、超净台、30℃恒温培养箱、37℃恒温培养箱、39℃培养箱、天平、摇床、水浴锅、电泳凝胶成像分析系统、Bio-Rad PCR仪、恒温培养箱、显微镜、酶标仪等。

1.2 方法

菌株保存与培养 新生隐球菌菌株在含10%甘油YPD液体培养基中于-80℃冰箱中保藏，使用时划线接种于YPD固体培养基上，30℃培养2 d，取单克隆单克隆菌落在YPD液体培养基30℃摇菌过夜。

基因敲除与回复 以H99基因组为模版，合成基因编码区两端各1 000 bp左右的DNA片段，以pJL517为模版合成抗性筛选基因片段，使用overlap PCR的方法连接基因上游片段，抗性基因片段以及基因下游片段。取隐球菌单克隆菌落摇菌、清洗、重悬后加入YPD+1 mol/L山梨醇培养基，用玻璃珠涂匀，30℃孵育备用。纯化和浓缩上述获得的DNA片段，将金粉与DNA混匀，基因枪轰击平铺于YPD+1 mol/L山梨醇培养基的隐球菌。将样品放入培养箱中孵育4 h，加入刮板，将菌悬液转移至选择培养基，30℃孵育3～5 d，选取10个单克隆转移到YPD培养基，重复2次，再将菌落转移到选择培养基，确认抗性稳定，使用PCR验证。PCR构建回复基因片段，包含基因编码区，及其前后各1 000 bp的区域，同时将pCH233线性化，通过In-Fusion HD Cloning Kits合成质粒，选取验证后敲除基因的菌株，按上述方法通过基因枪转化，选择培养基筛选回复株，选取阳性克隆的验证。

体外应激应答检测 挑取单克隆摇菌、清洗、重悬，将浓度最终调整为2.5×108cells/mL，将配好浓度的菌悬液加入到96孔板中，倍比稀释成6个浓度，分别为2.5×108cells/mL、2.5×107cells/mL、2.5×106cells/mL、2.5×105cells/mL、2.5×104cells/mL、2.5×103cells/mL备用。依照配方制备新鲜培养基，所需配方见实验材料培养基。使用排枪每孔取4 μL的菌液，平行点到培养基上。干燥后放入相应的温度下培养3～5 d，将相应的培养基生长结果照相。

黑色素诱导实验 配制菌悬液浓度到2.5×108cells/mL，取4 μL滴入DOPA培养板，分别置于30℃和37℃培养箱中培养3、5、7 d，并分别拍照。

隐球菌荚膜的诱导 将隐球菌在沙堡弱液体培养基中摇菌过夜，离心洗涤后使用PBS稀释10倍的沙堡弱液体培养基(加入MOPS缓冲液调整至50 mmol/L)配制浓度为5×106cells/mL于培养板中培养24 h拍照，使用ImageJ软件每株测量80～100个内外径长度。

隐球菌尿素酶检测 配制2.5×108cells/mL菌悬液，取4 μL加入尿素培养板，分别放入30℃和37℃培养箱，24 h后拍照。

生长曲线的测定 配制菌悬液浓度为1×106cells/mL、1×103cells/mL，将200 μL菌悬液加入96孔板中，37℃每隔6 h在OD600读数，将读数录入GraphPad Prime5绘制生长曲线。

酵母双杂交实验 以SER5基因cDNA为诱饵构建膜酵母双杂交诱饵载体，筛选膜酵母双杂交pPR3N-FW cDNA文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定与Ser5相互作用的蛋白基因。

2 结 果

2.1 基因敲除菌及回复株构建成功

通过PCR扩增Ser5编码片段，敲除株Ser5编码片段没有出现，回复株Ser5编码片段阳性，说明ser5Δ，ser5Δ+SER5构建成功。鉴定结果见图1。

图1 SER5基因敲除及回复验证PCR电泳结果Fig.1 Validation of SER5 gene knocking-out and reconstitution

2.2 体外应激实验

ser5Δ在不同温度下、氧化应激、高盐高渗、细胞壁应激培养基生长与野生株和回复株相比无明显差异(见图2)，提示丝氨酸蛋白酶Ser5对隐球菌温度敏感性、氧化应激、高盐高渗耐受及细胞壁功能完整性没有显著影响。

图2 体外应激实验：A.温度；B.硝化应激和氧化应激；C.高盐高渗；D.细胞膜和细胞壁应激ser5Δ无明显变化Fig.2 The phenotypes of ser5Δ mutants in stress: A. Temperature sensitivity; B. Oxidative and nitrosative stress C. High salts and osmotic stress; D. Cell-wall and cell-membrane stress. ser5Δ didn’t show increased sensitivity to stress compared to WT and ser5Δ +SER5 reconstituted strains.

2.3 Ser5参与黑色素的诱导

ser5Δ在30℃培养表现为黑色素生成显著减少，黑色素的缺失在37℃更加明显(见图3)。当SER5基因回复时，ser5Δ+SER5恢复了黑色素产生能力，说明SER5在黑色素诱导过程中发挥作用。

图3 菌株在左旋多巴培养基黑色素诱导实验 ser5Δ在30℃培养表现为黑色素生成显著减少，黑色素的减少在37℃更加明显；回复株ser 5Δ+SER5 恢复了黑色素生成能力。Fig.3 Growth of ser mutants on L-DOPA media. ser 5Δ exhibited melanin synthesis decreasing on DOPA medium 30℃,and this defect was exacerbated at 37℃, and the phenotype was recuperated in the ser 5Δ+SER5 reconstituted strains

2.4 Ser5对隐球菌荚膜无明显影响

ser5Δ对隐球菌荚膜诱导无显著影响，荚膜大小与野生株和回复株无明显差异(P>0.05，见图4),提示Ser5对荚膜合成无显著影响。荚膜大小的比较取外径与内径的比值，统计使用SPSS 18.0进行单因素方差分析，以P<0.05视为有统计学意义。

2.5 Ser5对尿素酶无明显影响

在30℃和37℃下，ser5Δ分解尿素能力与野生株和回复株无明显差异(见图5)，提示Ser5对隐球菌尿素酶无显著影响。

图4 荚膜诱导实验：A.荚膜诱导后墨汁染色；B.荚膜厚度统计. ser5Δ荚膜无明显变化 图5 尿素酶实验：ser5Δ对尿素分解能力无明显变化Fig.4 Capsule growth on diluted Sabouraud's medium. A: Picture of a representative cell in an India Ink suspension. B: Measurement of the capsule size for the samples described above. The size of the capsule in ser5Δ showed no significant difference compared to WT and ser5Δ +SER5 reconstituted strains Fig.5 Growth of ser mutants on urea media. ser5Δ exhibited normal urease ability

2.6 Ser5不影响隐球菌的生长速率

在37℃下，ser5Δ在低浓度和高浓度下生长速率与野生株和回复株相比未见明显差异(见图6)，提示Ser5不影响隐球菌的生长速率。

图6 生长速度实验：A.起始浓度103 /mL；B.起始浓度106 /mL. ser5Δ生长无明显变化Fig.6 The mutants grown rates at 37℃. A. Cell density at 103 cells/mL; B. Cell density at 106 cells/mL. ser5Δ showed normal grown rate

2.7 Ser5可能与19种蛋白存在相互作用。

酵母双杂交文库中筛选到了32个酵母初始阳性菌落，经过初步鉴定，32个全部能激活ADE2、HIS3和LacZ报告基因，通过抽提阳性克隆质粒DNA进行测序和BLAST比对分析，去除多次测序无结果和查无结果克隆，筛选出28个阳性克隆分别属于19种不同的蛋白编码基因(见表2)。

表2 回转验证Ser 5的相互作用蛋白基因列表Tab.2 The list of interacting protein genes of Ser 5

3 讨 论

蛋白酶一直被认为是病原性真菌的毒力因子之一，很多病原性真菌在体外或感染时会分泌蛋白酶[6]，有研究表明，隐球菌蛋白酶可能与隐球菌从肺泡侵入肺组织以及通过血脑屏障过程中起重要作用[7-9]，而丝氨酸蛋白酶是最大的一类蛋白酶家族。有研究表明，新生隐球菌Ser5编码基因在体内，体外CSF，YPD生长时持续高表达且差异明显[10]，为了进一步研究SER5基因的功能，本研究构建了SER5基因的缺失菌株，通过表型分析发现Ser5可影响新生隐球菌黑色素的生成。黑色素是保护真菌抵御氧化、化学和物理降解的重要物质，可以保护菌体在体内被免疫细胞氧化杀伤[11]。在新生隐球菌中，黑色素合成机制目前尚不清楚，黑色素的合成涉及到合成、转运、聚集、沉积的过程，是在漆酶的作用下在小囊泡或者黑色素小体上进行，然后含有黑色素的转运囊泡将黑色素运送到细胞壁上形成黑色素环，被黑色素环覆盖的隐球菌对氧化刺激、酸性环境、冷热压力及抗生素有更强的抵抗性[12]。黑色素合成的影响因素很多，其关键酶是漆酶(Lac1)，其他因素包括温度、多价阳离子、泛素、转录因子等[13]，但目前尚无丝氨酸蛋白酶影响黑色素生成的报道。

为了进一步研究Ser5影响黑色素合成的可能机制，通过酵母双杂交技术筛选了与Ser5相互作用的蛋白。在与Ser5相互作用的蛋白中，包含囊泡相关膜蛋白VAMP7(XM_012190826.1，CNAG_07029)、甾醇还原酶ERG4(XM_012192772.1，CNAG_02830)[14]、磷脂转运蛋白(XM_012192724.1，CNAG_02761)[15]、GDP-甘露糖转运蛋白GMT1(XM_012195163.1，CNAG_05817)[16]、内质网稳定蛋白YOP1(XM_012195364.1，CNAG_06646)[17]、乙醇胺磷酸转移酶(XM_012195294.1，CNAG_06543)、膜泡运输t-SNAREs同源物Vti1a(XM_012195775.1, CNAG_03306)、内质网蛋白(XM_012190932.1，CNAG_00469)、天冬氨酸转移酶(XM_012197702.1, CNAG_06026)等。上述与Ser5相互作用蛋白中，内质网蛋白和内质网稳定蛋白可能与黑色素合成相关，VAMP7、磷脂转运蛋白、Gmt1、Vti1a可能与黑色素膜泡运输相关，提示Ser5可能参与黑色素的合成或转运过程。

综上，本研究成功构建了SER5基因的缺失菌株, 通过体外应激应答、黑色素诱导、荚膜诱导、尿素酶测定、生长曲线测定、酵母双杂交实验探究SER5基因在新生隐球菌中的功能，结果SER5基因敲除后，新生隐球菌对外界应激反应、荚膜、生长、尿素酶无明显变化，黑色素合成显著减少，提示Ser5在新生隐球菌黑色素合成中发挥着重要作用，通过酵母双杂交实验，筛选了部分与Ser5相互作用的蛋白，为进一步研究Ser5的功能提供了研究基础，相关蛋白的具体作用机制尚需进一步的分子研究来证实。