LINC01176对非小细胞肺癌细胞侵袭和迁移的影响及其与上皮—间质转化的关系

黄云，傅文凡，戴璐，江泽勇，吴文杰，赵健

广州医科大学附属肿瘤医院胸外科，广州510095

肺癌是常见的恶性肿瘤，分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）两种主要的组织学亚型，其中NSCLC是最主要的发病类型［1］。据统计，60% 以上的NSCLC 患者在初次就诊时就发现有恶性肿瘤转移而失去了手术机会，而50% 以上接受手术治疗的NSCLC患者会再次复发并出现转移［2］。因此，探索NSCLC 转移的机制对改善NSCLC 患者生存率具有重要意义。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度大于200 nt 的不编码蛋白质RNA 分子，主要通过与蛋白质、miRNA 和mRNA 等大分子相互作用来参与表观遗传、基因转录和蛋白质翻译等分子调控过程，从而参与调控细胞的增殖、凋亡和迁移［3］。研究发现，lncRNA 的异常表达与恶性肿瘤密切相关［4］。我们前期通过TCGA 数据库分析发现，lncRNA LINC01176在NSCLC细胞中表达上调，但其在NSCLC 中的作用机制尚不明确。上皮—间质转化（EMT）是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，其主要的特征有细胞黏附分子（如E-cadherin）表达减少、细胞骨架由角蛋白为主转化为波形蛋白（Vimentin）为主等［5］。NSCLC 是上皮细胞来源的肿瘤，NSCLC 上皮细胞发生间质化改变是转移过程中至关重要的一个步骤［6］。2020年10 月—2021年5 月，本研究观察了LINC01176在NSCLC细胞中的表达情况及其对肿瘤细胞侵袭和迁移的影响，并探讨其是否通过调控EMT参与肿瘤细胞的转移过程。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人正常肺上皮细胞株16HBE，人NSCLC 细胞株A549、H1299、H1975和H1650均购自武汉普诺赛公司；LINC01176 siRNA 和LINC01176 siRNA 对照无干扰序列由上海吉玛基因公司设计合成。1640 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司，逆转录试剂盒购自日本ToYoBo公司，实时荧光定量检测试剂盒购自日本TaKaRa 公司，Tranwell小室购自美国Corning公司。上皮标志物Ecadherin、间质标志物Vimentin 一抗及二抗均购自美国CST公司，GAPDH抗体购自美国Affinity公司。

1.2 正常肺上皮细胞、NSCLC 细胞培养及LINC01176 表达检测 用含10% 胎牛血清的1640完全培养基分别培养正常肺上皮细胞16HBE，NSCLC 细胞A549、H1299、H1975 和H1650，将细胞置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中，每2 d更换一次新鲜培养基。当细胞融和度达80%～90%时，用0.25% 的Trypsin-EDTA 溶液消化传代。采用实时荧光定量PCR法检测LINC01176表达。收集对数生长期的16HBE、A549、H1299、H1975 和H1650细胞，使用TRIzol 试剂分别提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒操作说明逆转录合成cDNA，以cDNA 为模板进行PCR 扩增。引物序列：LINC01176 上游引物为5′-TGGATGGTTTAGCATTATCCC-3＇，下游引物为5′-CTCCAGCCAATACTTTAAACAG-3′；GAPDH上游引物为5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物为5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。以GAPDH 为内参，按2-ΔΔCt计算LINC01176 相对表达量。取LINC01176 相对表达量最高的NSCLC 细胞进行后续研究。

1.3 NSCLC 细胞分组与转染 细胞转染前1 d 用6孔板铺板，每孔细胞数为2×105～4×105，待细胞融合率达70%～80%即可进行转染。将细胞分为转染敲低组和转染对照组，分别按照LipofectamineTM3000试剂盒说明书转染LINC01176 siRNA 和LINC01176 siRNA对照无干扰序列48 h。

1.4 NSCLC 细胞侵袭能力观察 采用Transwell 实验。取对数生长期的两组细胞，用无血清1640 培养基制作细胞悬液，离心重悬后调整细胞密度至5×105/mL，以5×104/孔接种于上室，取500 µL 含10%胎牛血清的1640 培养基置于下室。37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱培养24 h 后取出Transwell 小室，PBS 清洗1 遍，甲 醇固定20 min，1% 结晶 紫染色15 min，用棉签轻柔擦去上室未迁移细胞后用水清洗并晾干。小室干后将小室置于倒置显微镜下直接计算下室穿膜细胞数并拍照，穿膜细胞数越多表示细胞侵袭能力越强。

1.5 NSCLC 细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。使用马克笔在6 孔板背后沿直尺均匀划5 条横线，间隔为0.5～1.0 cm，横穿过孔。取两组细胞常规消化，以5×105/孔接种至6 孔板过夜培养，使用小枪头沿直尺尽量垂直于背后的横线在6 孔板中间划痕。PBS 洗涤3 次，洗去划下的细胞。加入无血清培养基37 ℃培养并拍照（0 h），12 h后在相同位置拍照，使用荧光倒置显微镜标尺计算0 h～12 h的细胞迁移距离。

1.6 NSCLC细胞EMT情况观察

1.6.1 E-cadherin、Vimentin mRNA 表达检测 采用实时荧光定量PCR 法。取对数生长期的两组细胞，操作方法同“1.3”。引物序列：E-cadherin 上游引物5′-GGGGTCTGTCATGGAAGGTG-3′，下游引物5′-CGACGTTAGCCTCGTTCTCA-3′；Vimentin 上 游引物5′-GCACATTCGAGCAAAGACAGG-3′，下游引物5′-TGAGGGCTCCTAGCGGTTTA-3′。以GAPDH为内参，按2-ΔΔCt计算E-cadherin、Vimentin mRNA 的相对表达量。

1.6.2 E-cadherin、Vimentin 蛋白表达检测 采用Western Blotting 法。收集对数生长期的两组细胞，加入适量RIPA 裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF；冰浴裂解细胞15 min，用细胞刮刮取裂解物并将其吸入1.5 mL 的EP 管中；超声裂解8 次后4 ℃12 000 g 离心15 min，吸取上清液至另一1.5 mL的EP管。BCA试剂盒测量蛋白浓度，100 ℃煮沸10 min 后进行SDS-PAGE 电泳。电泳后将蛋白湿转于PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h后，剪下所需的目的条带；加入E-cadherin、Vimentin 一抗，4 ℃平衡摇床轻摇孵育过夜。PBST摇床漂洗3次，每次10 min；加入相应二抗摇床孵育，PBST 摇床漂洗3 次，每次10 min；用ECL发光液发光显影，测定各条带灰度值，以目的蛋白条带与内参GAPDH 条带灰度值的比值表示E-cadherin、Vimentin蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。计量资料以± s 表示，组间比较行t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC01176 在正常肺上皮细胞及NSCLC 细胞中的表达比较 LINC01176 在正常肺上皮细胞16HBE 及NSCLC 细胞A549、H1299、H1975 和H1650 中的相对表达量分别为1.00 ± 0.01、6.82 ±0.33、13.19 ± 1.50、99.35 ± 0.81、6.89 ± 1.73，LINC01176在NSCLC细胞中的相对表达量均高于正常肺上皮细胞（P均<0.05），其中H1975 细胞的LINC01176表达量最高。

2.2 LINC01176 对H1975 细胞侵袭的影响 转染敲低组和转染对照组穿膜细胞数分别为（847.33 ±50.06）、（1 715.67 ± 55.47）个，转染敲低组穿膜细胞数少于转染对照组（P<0.05）。

2.3 LINC01176对H1975细胞迁移的影响 转染敲低组和转染对照组细胞迁移距离分别为（489.37 ±16.14）、（556.07 ± 12.41）µm，转染敲低组细胞迁移距离小于转染对照组（P<0.05）。见图1。

图1 LINC01176对H1975细胞迁移的影响（细胞划痕实验）

2.4 LINC01176对H1975细胞E-cadherin、Vimentin表达的影响 转染敲低组E-cadherin mRNA 及蛋白表达量均高于转染对照组，Vimentin mRNA 及蛋白表达量均低于转染对照组（P均<0.05）。见表1。

表1 LINC01176对H1975细胞E-cadherin、Vimentin蛋白表达的影响（ ± s）

表1 LINC01176对H1975细胞E-cadherin、Vimentin蛋白表达的影响（ ± s）

注：与转染对照组比较，*P<0.05。

组别转染对照组转染敲低组E-cadherin mRNA 1.00 ± 0.09 2.58 ± 0.20*蛋白1.00 ± 0.13 3.36 ± 0.08*Vimentin mRNA 1.00 ± 0.15 0.51 ± 0.03*蛋白1.00 ± 0.10 0.58 ± 0.05*

3 讨论

肿瘤细胞转移是包括肺癌在内的恶性肿瘤致命的主要原因，越来越多的研究发现，lncRNA 参与调控恶性肿瘤细胞的转移［7］。研究显示，lncRNA 肺腺癌转移相关转录物1（MALAT1）可作为调控miR124/STAT3 和miR206/AKT 信号通路的竞争性内源RNA（ceRNA）促进肺癌的发生发展，其还可通过与人体抑癌基因p53启动子结合来抑制p53活性，调控影响肺肿瘤细胞周期进展的下游基因，促进肺肿瘤细胞的迁移和侵袭［8］。lncRNA HOX 转录反义RNA（HO⁃TAIR）被发现在肺肿瘤组织中高表达，可促进肺肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭［9］。lncRNA 肺癌相关转录本1（LCAT1）可通过吸附miR-4715-5p 作为ceRNA发挥促癌作用，其在肺肿瘤组织中表达上调，且其上调程度与肺癌患者的预后成反比［10］。本研究通过TCGA 数据库分析发现，LINC01176 在NSCLC 中表达上调，这与我们的实时荧光定量PCR 结果相一致。进一步分析LINC01176 对NSCLC 细胞侵袭及迁移的影响，发现LINC01176 能够抑制NSCLC 细胞的侵袭和迁移，即LINC01176 参与了NSCLC 细胞转移的调控过程。目前，尚未有关于LINC01176 的文献研究报道，其在细胞中的作用仍有待进一步研究。

恶性肿瘤转移是一个非常复杂的多步骤过程，包括肿瘤细胞从细胞外基质分离、突破相关屏障进入血液、在血液中存活、突破相关屏障定植于远处组织、在转移部位生长等［11］。在NSCLC 中，肿瘤细胞的转移与EMT 密切相关［12］。在胚胎发育、炎症反应、组织重建等正常生理过程中，通过EMT 的作用，黏附细胞之间的连接开始消失，细胞获得运动能力，然后迁移到新的部位发挥生物学功能［13］。在肿瘤组织中，为了侵袭临近组织、扩散到远处组织并形成转移灶，肿瘤上皮细胞必须转变成间质表型。EMT 在这一转变过程中起到至关重要的作用，使得肿瘤上皮细胞失去了细胞极性、与基底膜的连接等上皮表型，同时获得了抗凋亡、可降解细胞外基质等间质表型，从而导致细胞具有较高的迁移性和侵袭性［14］。在细胞发生EMT 的生物学过程中，细胞黏附分子（如E-cadherin）表达减少，细胞角蛋白细胞骨架转化为Vimentin 为主的细胞骨架［15］。E-cadherin 是跨膜糖蛋白，参与维持上皮细胞间的连接和组织［16］。Vimentin 是中间丝蛋白，在细胞迁移、维持细胞结构和细胞运动中发挥重要作用［17］。本研究结果显示，转染敲低LINC01176 可抑制间质细胞标志物Vimentin 的表达、促进上皮细胞标志物E-cadherin的表达。这提示转染敲低LINC01176 可抑制EMT过程、降低肿瘤细胞远处转移的风险，LINC01176可通过调控EMT过程促进肿瘤细胞转移。

综上所述，LINC01176在NSCLC细胞中高表达，可促进NSCLC 细胞的侵袭和迁移，其作用可能是通过参与调控EMT 实现的。在未来的研究中，我们将进一步探究LINC01176 调控EMT 的具体分子机制，以及LINC01176在NSCLC转移中的临床应用。