CXCL12/CXCR4通路在人肺腺癌细胞诱导破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化中的作用

陈聪，赵雪强，林云，蒋碧佳，李宁，银建华，卢春兰，周成风，曾锦荣

桂林医学院第二附属医院呼吸与危重症医学科，广西桂林541199

肺癌是引起人类死亡最常见的恶性肿瘤之一。随着手术、放化疗、靶向治疗及免疫治疗等综合治疗的开展，肺癌患者的中位生存期较前明显延长，但骨转移发生率亦随之增高。这导致肺癌患者治疗负担日益加重，必须采用积极有效的防治措施。趋化因子受体4（CXCR4）于2001年被发现，在恶性肿瘤组织中表达升高，并与疾病的不良预后有关［1］。趋化因子12（CXCL12）是CXCR4 的惟一配体，其水平反映CXCR4 活性。CXCL12/CXCR4 通路与白细胞运输、癌性骨痛和术后疼痛等一系列生理、生化及病理过程有关，也是肿瘤细胞与体内微环境沟通的重要物质［2］。白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）是常见的炎症细胞因子，其在肿瘤骨侵袭破坏的微环境中起促进作用。2019年10 月—2021年2 月，我们观察了CXCR4 竞争性拮抗剂AMD3100干预肺腺癌A549 细胞与破骨细胞前体细胞共培养后破骨细胞的分化情况，初步探讨通过抑制CX⁃CL12/CXCR4是否能影响破骨细胞的分化及其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人肺腺癌细胞株A549、破骨细胞前体细胞（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7）均购于中科院昆明细胞库；AMD3100购自上海陶素生化科技有限公司；胎牛血清（FBS）、DMEM 培养液购自美国赛默飞世尔科技公司；Transwell 小室购自美国康宁公司；抗酒石酸碱性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒购自上海贝博生物科技有限公司；TRNzol Universal 总RNA 提取试剂、第一链cDNA 合成试剂盒及破骨细胞标志物组织蛋白酶K（CTSK）、降钙素受体（CTR）、TRAP、破骨细胞分化因子受体（RANK）荧光定量试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；CXCL12、IL-6、TNF-α 检测试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 RAW264.7、A549细胞培养 将RAW264.7、A549 细胞分别接种于含10% FBS 的高糖DMEM 培养液中，在37 ℃、5% CO2下培养，2～3 d 传代1 次，待细胞生长至对数生长期用于后续实验。

1.2.2 RAW264.7 细胞分组与干预处理 取对数生长期的A549 和RAW264.7 细胞，PBS 洗涤2 遍后胰酶消化A549 细胞，吹落RAW264.7 细胞；以800 r/min 离心5 min，加入配制好的DMEM 培养基分别制备成1×104/mL 的A549 单细胞悬液及2×103/mL 的RAW264.7 单细胞悬液，并将RAW264.7细胞随机分为干预组和对照组。两组均在6 孔的Transwell 下室接种RAW264.7 细胞，上室接种A549细胞，并保证上室的细胞培养在下室培养基中；干预组在小室内分别加入含12.5、25.0、50.0、100.0 µg/mL AMD3100的培养基，对照组仅加入培养基；两组均置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养7 d，每2～3 d 换液1 次。

1.2.3 RAW264.7 细胞向破骨细胞分化情况观察 采用TRAP 染色法。取用两组培养7 d 的Tran⁃swell 小室，去除Transwell 上室，弃除下室内剩余培养基；用PBS 洗涤2 遍，用TRAP 固定液4 ℃避光固定60 s；水洗，稍微晾干。加入TRAP孵育液工作液，37 ℃避光浸染1 h 后水洗；用苏木紫染色液复染4 min后水洗晾干，镜检。在高倍光学显微镜下随机取5 个视野并进行计数，细胞核数目≥3 个且TRAP染色阳性视为破骨细胞。

1.2.4 破骨细胞标志物CTSK、CTR、TRAP、RANK mRNA 表达检测 采用qPCR 法。取两组培养7 d 的Transwell 小室，去除Transwell 上室，弃除下室内剩余培养基；用PBS 洗涤2 遍，用TRIzol 试剂从细胞中提取总RNA；按提供的试剂操作步骤进行操作，用第一链cDNA 合成试剂盒将RNA 逆转录为cDNA。引物序列：CTSK 上游为5′-TATGACCACT⁃GCCTTCCAATAC-3′，下游为5′-GCCGTGGGGT⁃TATACATACA-3′；CTR上游为5′-CTGATTGTCATG⁃GCTGTGTTTAC-3′，下游为5′-GCCGTGGGGTTATA⁃CATACA-3′，TRAP 上游为5′-GTCAAGAACTTGC⁃GACCATTG-3′，下游为5′-CGTTCTCGTCCTGAA⁃GATACTG-3′；RANK 上游为5′-GAAGATTCCCA⁃CAGAGGATGAG-3′，下游为5′-TTGCTTCCCTGCT⁃GGATTAG-3′；内参GAPDH 上游为5′- GGAGA⁃AACCTGCCAAGTATGA -3′，下游为5′- TCCTCAGT⁃GTAGCCCAAGA -3′。qPCR 反应体系10 µL；反应条件：95 ℃预变性15 min 后，95 ℃变性10 s，60 ℃退火、延伸25 s，共40个循环。以GAPDH为内参，通过2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.2.5 小室上清液中细胞因子CXCL12、IL-6、TNF-α 水平检测 采集Transwell 小室上清液，采用ELISA 法检测CXCL12、IL-6、TNF-α，按试剂盒操作步骤进行操作。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。计量资料以±s 表示，多组间比较行多因素方差分析，组间两两比较行LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组RAW264.7 细胞分化为破骨细胞的数量比较 干预组在12.5、25.0、50.0、100.0 µg/mL AMD3100 处理后，RAW264.7 细胞向破骨细胞分化数量分别为（81 ± 3）、（49 ± 3）、（34 ± 3）、（11 ± 2）个，均低于对照组的（99 ± 5）个（P均<0.05）；且随着AMD3100 处理浓度的增加，RAW264.7 细胞向破骨细胞分化数量逐渐减少（P均<0.05）。

2.2 两组破骨细胞标志物CTSK、CTR、TRAP、RANK mRNA 表达比较 与对照组比较，干预组在不同浓度AMD3100 干预后破骨细胞标志物CTSK、CTR、TRAP、RANK mRNA 表达减少（P均<0.05）；且随着AMD3100处理浓度的增加，破骨细胞各标志物表达逐渐减少（P均<0.05）。见表1。

表1 两组破骨细胞标志物TRAP、CTSK、CTR、RANK mRNA表达比较（±s）

表1 两组破骨细胞标志物TRAP、CTSK、CTR、RANK mRNA表达比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与干预组上一浓度比较，#P<0.05。

组别干预组12.5 µg/mL AMD3100 25.0 µg/mL AMD3100 50.0 µg/mL AMD3100 100.0 µg/mL AMD3100对照组TRAP mRNA 0.69 ± 0.04*0.45 ± 0.03*#0.28 ± 0.02*#0.21 ± 0.02*#1.00 ± 0.02 CTSK mRNA 0.72 ± 0.08*0.37 ± 0.03*#0.32 ± 0.01*#0.14 ± 0.03*#1.00 ± 0.02 CTR mRNA 0.66 ± 0.04*0.50 ± 0.03*#0.38 ± 0.04*#0.23 ± 0.04*#1.00 ± 0.03 RANK mRNA 0.52 ± 0.04*0.33 ± 0.01*#0.19 ± 0.04*#0.12 ± 0.01*#1.00 ± 0.01

2.3 两组小室上清液CXCL12、IL-6、TNF-α 水平比较 与对照组比较，干预组在不同浓度AMD3100干预后小室上清液CXCL12、IL-6、TNF-α 水平降低（P均<0.05）；且随着AMD3100 处理浓度的增加，小室上清液CXCL12、IL-6、TNF-α 水平逐渐降低（P均<0.05）。见表2。

表2 两组小室上清液CXCL12、IL-6、TNF-α水平比较（±s）

表2 两组小室上清液CXCL12、IL-6、TNF-α水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与干预组上一浓度比较，#P<0.05。

组别干预组12.5 µg/mL AMD3100 25.0 µg/mL AMD3100 50.0 µg/mL AMD3100 100.0 µg/mL AMD3100对照组CXCL12（ng/mL）22.69 ± 3.43*16.80 ± 0.92*#13.02 ± 0.57*#4.33 ± 1.49*#36.27 ± 1.80 IL-6（pg/mL）42.17 ± 2.35*34.00 ± 3.25*#25.26 ± 2.60*#6.71 ± 1.61*#62.75 ± 2.52 TNF-α（pg/mL）65.46 ± 5.28*#46.83 ± 1.04*#33.51 ± 0.51*#16.79 ± 6.74*#94.59 ± 3.38

3 讨论

肺癌是近年来引起人类死亡最常见的恶性肿瘤之一，经过手术、放化疗、靶向治疗及免疫治疗等综合治疗后，患者的中位生存期较前明显延长［3］，但肺癌骨转移的发生率亦随之增高。肺癌发生骨转移时，肿瘤细胞首先与细胞外基质分离，然后迁移、侵袭并渗入血液循环中，当其到达骨骼后继续增殖并形成新的肿瘤转移灶。骨转移一旦发生，往往预后较差，是临床上降低肺癌患者生活质量和影响其生存的重要因素。研究发现，肿瘤细胞、破骨细胞、成骨细胞和骨基质细胞相互作用，促进溶骨性骨转移的形成和发展，抑制以上任何一个因素都有可能降低骨转移的发生率。

近年来，对于趋化因子及其受体与肺癌的研究逐渐成为热点。目前，已经明确CXCR4在多种肿瘤细胞中高表达，其在肺癌患者原发病灶组织、转移淋巴结及骨转移灶的表达均有升高［4］，并与肿瘤生长及转移有关［5］。CXCL12是CXCR4的惟一配体，两者构成CXCL12/CXCR4启动下游信号通路以维持组织体内的平衡，在参与免疫细胞的生存与转运的同时也支持肿瘤细胞的生长与转移［2］。 CXCR4 拮抗剂AMD3100 的作用基础是竞争性抑制CXCL12 与CXCR4结合，抑制CXCL12/CXCR4造成的生物学效应。在该实验中我们使用AMD3100干预肺癌骨转移模型，通过TRAP染色确定使用AMD3100干预后肺癌骨转移模型中破骨细胞数量减少；通过对共培养模型中细胞mRNA的测定，发现破骨细胞标记基因CTSK、CTR、TRAP、RANK mRNA表达减少；在共培养模型上清液中检测到IL-6、TNF-α及CXCL12分泌下降。

破骨细胞是由骨髓中髓系祖细胞分化而成的单核巨噬细胞相互融合形成的多核巨细胞［6］，其分化的经典信号通路包括巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）、NF-κB配体RANKL以及免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）共刺激信号通路［7］。破骨细胞分化的典型途径需要存在RANKL 和M-CSF 的受体激活剂，但一部分细胞因子或生长因子可以替代RANKL或M-CSF 以诱导破骨细胞形成，如TNF-α、IL-6、IL-11 和IL-8 等；同时，这些生长因子也可以影响RANKL/M-CSF诱导的破骨细胞形成［8］。研究显示，IL-6在肺癌细胞株高分泌，并能增加肺癌细胞上皮—间充质转化和转移进而影响肺癌的转移［9-10］；有回顾性研究表明，IL-6 的高分泌与骨转移的发展有显著相关性［11］。TNF-α 是一种多功能细胞因子，其持续高分泌可以促进肿瘤的侵袭，而TNF-α 高分泌肿瘤患者通常具有较高的转移率与复发率［12］。研究发现，破骨细胞的形成离不开其细胞外基质和营养。在肺癌骨转移病灶中，一系列的细胞因子、趋化因子对骨转移灶的形成与进展起重要作用，如CXCL12、IL-6、TNF-α、RANKL 等，这些因子可以促进破骨细胞的分化、增殖和活化［13］。在肺癌骨转移病灶中，CXCL12、IL-6、TNF-α、RANKL 等一系列细胞因子、趋化因子对骨转移灶的形成与进展起重要作用，并促进破骨细胞的分化、增殖和活化；不断生成的肿瘤细胞会分泌更多的因子，促进破骨细胞的生成，导致发生进一步的溶骨，形成“恶性循环”，进而在骨组织局部形成肿瘤微转移灶［14］。

综上所述，AMD3100 通过影响CXCL12/CXCR4通路活性，减少细胞因子如IL-6、TNF-α 和CXCL12的分泌，抑制人肺腺癌细胞诱导破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化，并可能因此抑制肺癌骨转移病灶的发生和发展。但是，通过影响CXCL12/CXCR4 是如何降低IL-6、TNF-α 和CXCL12 的分泌，以及过表达CXCR4 及沉默CXCR4 又会如何影响肺癌骨转移中的细胞因子及基因，仍需要继续探索。