结肠癌组织中miR-383、Notch1 mRNA表达变化与患者临床病理参数及预后的关系

赵亮，张帅，王海龙

1 天津市中医药研究院附属医院普通外科，天津300120；2 天津市人民医院胃肠外科；3 天津市中医药研究院附属医院肿瘤科

结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，在我国已成为仅次于肺癌的第二大癌症，严重威胁居民生命健康［1］。尽管目前对结肠癌分子机制的研究取得了一定进展，但针对结肠癌的标准药物治疗疗效仍存在局限，寻找新的治疗靶点对预防和治疗结肠癌具有重要意义［2-3］。微小RNA（miRNA）是一种单链非编码内源性RNA 分子，能调控靶基因表达，在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用［4］。有研究发现，miR-383 在胃癌、宫颈癌中表达下调，并与肿瘤细胞周期进展、增殖、迁移、侵袭能力有关［5-6］。Notch1 是一种配体激活的转录因子，可与同源配体相互作用而改变蛋白构象，激活下游特定靶基因表达，在细胞发育、分化、增殖、凋亡等过程中发挥调节作用［7］。研究显示，miR-383 可以靶向Notch1 来抑制结肠癌细胞的增殖和迁移能力，但关于二者与患者临床病理参数及预后的关系尚无研究报道［8］。基于此，本研究观察了结肠癌患者肿瘤组织中miR-383、Notch1 mRNA 的表达变化，并探讨其与患者临床病理参数及预后之间的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 经天津市中医药研究院附属医院伦理委员会批准，收集2015年1 月—2016年5 月在我院行手术治疗结肠癌患者的临床资料。纳入标准：①经术后病理确诊为结肠癌；②未接受任何抗肿瘤治疗；③病理资料和随访资料完整；④患者或家属签署知情同意书。排除标准：①合并其他部位肿瘤；②合并肠道感染性疾病或溃疡性结肠炎；③合并心、肝、肾等重要脏器功能损害；④合并自身免疫性疾病。共筛选得到符合上述标准的结肠癌患者126例，其中男75 例、女51 例，年龄28～76（57.54 ±5.63）岁，肿瘤直径≥5 cm 55 例、<5 cm 71 例，分化程度低分化25 例、低中分化41 例、高分化60 例，TNM分期Ⅰ期57例、Ⅱ期36例、Ⅲ期18例、Ⅳ期15例，18例伴淋巴结转移、108例未有淋巴结转移。

1.2 结肠癌及癌旁组织标本获取 于术中切除结肠癌患者部分肿瘤组织以及距肿瘤组织>5 cm 的癌旁正常组织，立即液氮冷冻，于-80 ℃冰箱中保存组织待用。

1.3 结肠癌及癌旁组织miR-383、Notch1 mRNA 表达检测 采用RT-qPCR 法。各组织取50 mg 研磨后，使用TRIzol试剂盒提取总RNA，Takara试剂盒转录合成cDNA，使用SYBR Green Master Mix 进行PCR 扩 增。 miR-383 上 游 引 物5′-GCACACATT⁃GAAGAGGACAGAAC-3′、下游引物5′-TATT⁃GAAGGGGGTTCTGGTG-3′，Notch1 上 游 引 物5′-GAGGCGTGGCAGACTATGC-3′、下游引物5′-CTT⁃GTACTCCGTCAGCGTGA-3′，miR-383 内参U6 上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，Notch1 内参GAP⁃DH 上 游 引 物5′-AATGGACAACTGGTCGTGGAC-3′、下游引物5′-CCCTCCAGGGGATCTGTTTG-3′。PCR 反应条件：95 ℃30 s、95 ℃15 s、62 ℃30 s、72 ℃20 s，共40 个循环。采用2－ΔΔCt法计算目标基因miR-383、Notch1 mRNA的相对表达量。

1.4 患者预后观察 以患者出院日为起点，通过门诊或电话随访5年，记录患者生存情况，随访至2021年5 月截止。以miR-383、Notch1 mRNA 表达量中位数为界限，≥中位数为高表达者，<中位数为低表达者，绘制miR-383、Notch1 mRNA 高表达者与低表达者的Kaplan-Meier生存曲线。

1.5 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。计量资料以± s 表示，组间比较行t 检验；计数资料以例或率表示；采用Pearson相关性分析结肠癌组织miR-383、Notch1 mRNA表达量的关系；绘制Kaplan-Meier生存曲线，采用Log-Rank 检验比较miR-383、Notch1 mRNA 高表达者与低表达者的生存时间。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌及癌旁组织miR-383、Notch1 mRNA 相对表达量比较 结肠癌组织miR-383、Notch1 mRNA相对表达量分别为1.06 ± 0.10、1.98 ± 0.34，癌旁组织miR-383、Notch1 mRNA相对表达量分别为2.37 ±0.54、1.00 ± 0.08，结肠癌组织miR-383 相对表达量低于癌旁组织，Notch1 mRNA相对表达量高于癌旁组织（P均<0.01）。结肠癌组织miR-383、Notch1 mRNA相对表达量呈负相关关系（r=-0.665，P<0.01）。

2.2 不同临床病理参数患者结肠癌组织miR-383、Notch1 mRNA表达比较 见表1。

表1 不同临床病理参数患者结肠癌组织miR-383、Notch1 mRNA表达比较（± s）

表1 不同临床病理参数患者结肠癌组织miR-383、Notch1 mRNA表达比较（± s）

临床病理参数性别男 女年龄≥60岁<60岁肿瘤直径≥5 cm<5 cm分化程度低分化中高分化TNM分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期淋巴结转移无 有n 75 51 70 56 55 71 25 101 93 33 108 18 miR-383 1.07 ± 0.11 1.05 ± 0.09 1.06 ± 0.11 1.07 ± 0.09 1.05 ± 0.10 1.07 ± 0.10 1.04 ± 0.12 1.07 ± 0.10 1.08 ± 0.10 1.02 ± 0.10 1.07 ± 0.10 0.99 ± 0.10 t 0.73-0.68-0.82-1.13 2.50-3.12 P 0.46 0.49 0.40 0.25 0.01<0.01 Notch1 mRNA 2.03 ± 0.34 1.93 ± 0.34 2.01 ± 0.33 1.95 ± 0.36 2.02 ± 0.34 1.95 ± 0.35 2.09 ± 0.41 1.96 ± 0.32 1.94 ± 0.32 2.12 ± 0.38 1.94 ± 0.33 2.23 ± 0.30 t 1.58 0.98 1.12 1.63-2.58 3.43 P 0.11 0.97 0.26 0.10 0.01<0.01

2.3 结肠癌组织miR-383、Notch1 mRNA 高、低表达患者预后比较 miR-383 高表达59 例、低表达67 例，5年生存率分别为77.97%（46/59）、49.25%（33/67）；Notch1 mRNA 高表达62 例、低表达64例，5年生存率分别为45.16%（28/62）、79.69%（51/64）。miR-383 高表达者5年生存率高于低表达者，Notch1 mRNA 高表达者5年生存率低于低表 达 者（P均<0.05）。 结 肠 癌 组 织miR-383、Notch1 mRNA 高、低表达者Kaplan-Meier 生存曲线见图1。

图1 结肠癌组织miR-383、Notch1 mRNA高、低表达者Kaplan-Meier生存曲线

3 讨论

结肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，随着人们生活和饮食方式的改变及人口老龄化加剧，近年来结肠癌发生率和病死率呈上升趋势。结肠癌的治疗目前以手术为主，同时配合化疗、放疗等手段。因结肠癌细胞增殖能力以及对生物、放射、化学治疗的耐药性较强，所以切除后复发转移率高，超过30%的结肠癌患者在手术治疗后会出现局部复发或远处转移，且转移性患者5年生存率仅为10%，总体预后仍然较差［3］。

miRNA 是表观遗传学的重要一环，其是由约22个核苷酸组成的非编码RNA，可在3′-非翻译区与靶基因的mRNA结合，导致靶基因转录后沉默，从而调控靶基因的表达［9］。研究显示，结肠癌发生发展过程中存在多种miRNA 的异常表达，对结肠癌细胞增殖、迁移、浸润等生物学行为产生影响［10-11］。miR-219a-1 可靶向Memo1 抑制结肠癌细胞增殖和入侵［10］，miR-513b-5p 能够靶向转录激活因子3 抑制结肠癌细胞增殖和迁移［11］。miR-383 定位于人染色体8p22，在胚胎肝细胞、血管内皮细胞、肿瘤组织中有显著变化，与机体细胞增殖、分化、迁移等多种病理生理过程有关。多项研究表明，miR-383 与多种实体肿瘤有关［12-13］。CHENG 等［12］研究显示，miR-383能够靶向过氧化物还原酶-3 抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。陈石娇等［13］研究显示，miR-383 能下调mutS 同源物6 抑制小儿髓母细胞瘤的增殖和侵袭。本研究结果显示，miR-383 在结肠癌组织中的表达低于癌旁组织，并且与TNM 分期、淋巴结转移有关，提示miR-383 的低表达与结肠癌恶性进展有关。研究显示，上调miR-383 的表达可以抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力，其机制可能与miR-383 靶向增殖诱导配体、调节肿瘤高表达细胞周期相关蛋白抗体有关［14］。进一步绘制Kaplan-Meier 生存曲线，我们发现miR-383 高表达者术后5年生存率明显提升，说明miR-383 低表达与结肠癌患者预后不良有关，可作为判断预后的分子标志物。

传统观点认为，肿瘤的发生是癌基因激活与抑癌基因失活导致。随着分子研究的深入，新近观点认为，肿瘤发生是信号转导途径异常，使细胞接受异常增殖信号导致。Notch1 基因定位于人染色体9q34.3，作为一种配体激活的转录因子，Notch1能将胞外信号转化为核内基因表达，具备细胞表面受体和核转录调控的双重功能［15］。Notch1信号通路是一种高度保守的细胞间信号传导途径，参与调节个体发育和细胞增殖、分化、凋亡及血管新生等生物学功能，可通过激活磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白、核因子-κB 等多条信号通路促进恶性肿瘤发生［16］。本研究结果显示，Notch1 在结肠癌组织中表达高于癌旁组织，且与TNM 分期、淋巴结转移有关，提示Notch1 高表达参与结肠癌恶性进展，其机制可能与Notch1 可激活多条肿瘤相关信号通路有关。Kaplan-Meier 生存曲线显示，Notch1 高表达者术后5年生存率明显降低，说明Notch1 高表达与结肠癌患者预后不良有关，可作为判断预后的分子标志物。本研究结果还显示，结肠癌组织中miR-383 与Notch1 mRNA 表达呈负相关，说明二者共同参与结肠癌发生发展，这与Notch1 为miR-383 下游调控靶点有关。miR-383 可靶向结合Notch1 的3′-非翻译区，在结肠癌中，miR-383 高表达能抑制Notch1 表达，进而抑制结肠癌细胞增殖和迁移等能力，从而对患者预后产生影响［8］。

综上所述，miR-383 在结肠癌组织中低表达、Notch1 mRNA 在结肠癌组织中高表达，且两者的表达与TNM 分期、淋巴结转移及预后相关。miR-383、Notch1 mRNA可能成为新的结肠癌诊断和预后判断的分子标志物。但本研究样本量较少，两者之间的作用机制还需多中心大样本研究证实。