促红细胞生成素及其衍生物对神经保护作用的研究进展

胡明沛 王丹丹 徐明波 杨仲璠 曹荣月

1.中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京 210009；2.北京双鹭药业股份有限公司北京市重组蛋白及其长效制剂工程技术研究中心，北京 100143

促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是一种糖蛋白激素，受缺氧诱导，其主要作用是抑制骨髓中红系祖细胞的凋亡并促进其增殖、分化和成熟，临床上多用于治疗肾性贫血及肿瘤、早产等相关性贫血。近些年来，已在多种组织系统中观察到EPO 具有抑制细胞凋亡、减轻炎症反应、抵抗氧化应激及促进血管生成等保护作用，特别是神经系统[1]。然而EPO 用作神经保护剂时给药剂量较高，容易激发其造血活性，增加了高血压及血栓形成等风险[2]。规避该副作用的主要方法是使用非促红EPO 衍生物[3]，不同形式的EPO 衍生物作用机制有所不同，但均显示出抗氧化、抗凋亡与抗炎特性，已有越来越多的研究在动物及临床试验中证实了EPO 及其衍生物在治疗神经退行性疾病中的重要作用。

1 EPO 与EPOR

人EPO 基因定位于7 号染色体长臂中段，由5个外显子和4 个内含子组成。体内存在的活性EPO 分子含有165 个氨基酸，相对分子量为30.4 kD。EPO 通过两对二硫键形成4 个稳定的α 螺旋结构（A-D），其中A、C、D 是疏水性螺旋，参与结合促红细胞生成素受体（erythropoietin receptor，EPOR）。已在多种非红系组织中检测到EPO 和EPOR，提示EPO 具有非造血作用[4]。

EPOR 相对分子量为66 kDa，属于Ⅰ型细胞因子受体超家族，主要包括三个部分：一个胞外结构域，其包含两对提供配体结合位点的半胱氨酸残基和一段保守基序（WSXWS）；一个跨膜结构域和一个缺乏催化活性的胞内结构域。在造血系统中，EPO 与其经典受体的同型二聚体（EPOR）2结合并激活胞浆中的Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2），活化的JAK2 使EPOR 胞浆结构域中的8 个酪氨酸残基磷酸化，随后激活几种次级信号分子：信号转录激活因子5（signal transducer and activator of transcription 5，STAT5）、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），从而促进红系祖细胞增殖、分化为成熟的红细胞，发挥其主要的造血功能[5]。

2 EPO 衍生物与β 共同受体（Common β chain receptor，βCR）

第一个非促红EPO 衍生物是去唾液酸EPO（asialo-EPO），其糖链末端缺乏唾液酸残基保护，极易被肝脏中脱唾液酸蛋白受体识别从而被快速代谢，血浆半衰期由普通EPO 的约6 h 降至几分钟。值得一提的是，虽然组织保护性受体对EPO 的亲和力明显低于促红受体，但短暂接触足以诱导神经保护作用的产生。而EPO 发挥促红作用需要长时间结合（EPOR）2，造成这种差异的原因尚未完全确定[6]。因此，asialo-EPO 理论上可以发挥组织保护作用而不产生促红作用，但原则上它仍然能够激活（EPOR）2，多次大剂量的使用仍可能影响红细胞生成，且不利于深入研究EPO 保护作用机制，所以人们希望能够制备一种不与（EPOR）2结合但仍具有组织保护作用的EPO 衍生物[7]。

氨甲酰EPO（carbamylated erythropoietin，CEPO）即被开发出来，其是EPO 赖氨酸残基氨甲酰化的产物，也是第一个真正意义上被严格证实不具有促红活性的EPO 衍生物，因其既不与同二聚体（EPOR）2结合也不与单体EPOR 结合。但它仍然在包括大脑、心脏和肾脏等器官中呈现出与EPO 和asialo-EPO 相似的组织保护作用，Brines 等[8]认为这种组织保护作用是由EPOR与βCR 组成的异质二聚体EPOR/βCR 介导的。

βCR，又名CD131，与EPOR 同属于Ⅰ型细胞因子受体超家族，是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GMCSF）、白细胞介素（interleukin，IL）-3 及IL-5 等的共享受体[9]。已在包括神经系统、心脏、肾脏在内的多种组织器官中检测到EPOR 和βCR 的共表达，并证明了EPO 通过结合EPOR/βCR 介导组织保护作用[10]。

低唾液酸EPO（neuro-EPO）是唾液酸含量在4～7 mol/mol 的重组EPO 亚型，目前已进入脑部疾病的临床研究，主要通过鼻内途径进行给药[11]。在神经疾病治疗中，对于以唾液酸含量为出发点设计的EPO衍生物与EPO 本身，鼻腔给药是更理想的给药方式，因其可以绕过血脑屏障将药物直接递送至大脑，同时避免被肝脏代谢，所以只需给予较低剂量的EPO 即可发挥神经保护作用，大大降低了促红作用带来的血栓形成等风险，且起效更快[12]。

对EPO 构效关系的研究表明，螺旋B 远离EPO与EPOR 的结合位点，Brines 等[13]模拟了螺旋B 外部的亲水性表面，设计了一段包含11 个氨基酸残基的线性小分子多肽，即螺旋B 表面肽（helix B surface pep tide，HBSP），又名ARA290，其N 末端谷氨酰胺自发环化形成焦谷氨酸HBSP（pyroglutamate HBSP，pHBSP），由此具有更高的稳定性。与CEPO 相似，pHBSP 同样不与EPOR 结合，已证明其通过结合EPOR/βCR 在肾脏、大脑、心脏、肺等器官中发挥组织保护作用[14]。基于EPO 结构及其多样性受体的进一步研究，其他EPO模拟肽也在陆续开发中，包括Epobis、Epotris、JM-4、MK-X、NP1 和NP2 等[15]。

3 EPO 的神经保护作用及其机制

目前对EPO 在神经系统中作用与机制的研究，大量集中在缺血性脑损伤、阿尔茨海默症（Alzheimer′s disease，AD）和帕金森症（Parkinson′s disease，PD）等神经退行性疾病领域。

3.1 缺血性脑损伤

缺血性脑损伤的病理特征是细胞能量储备耗竭，引起Na+/K+泵衰竭、电压控制钙通道开放及谷氨酸释放并激活脂酶、一氧化氮（nitric oxide，NO）合成酶等，导致NO 过量产生、氧自由基生成及炎症细胞因子释放，最终激活半胱氨酸蛋白酶（cysteine aspartate-specific protease，Caspase）及其他凋亡分子，导致细胞死亡[16]。临床前研究表明EPO 在体内外均能抵抗由缺血和缺氧引起的神经元死亡，这取决于多种不同的机制，包括：抑制缺氧缺血导致的脑组织中NO 含量激增；上调抗氧化酶活性，保护大脑免受氧自由基的侵害，并改善高氧诱导的髓鞘缺陷[17]；抑制谷氨酸的细胞外释放；减轻炎症反应，下调IL-1、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 及IL-6 等炎症细胞因子的表达；保护神经胶质细胞及海马神经元，抵抗脑细胞凋亡[18]。

对EPO 在新生儿大脑中产生抗凋亡作用的相关分子机制的研究如下：缺氧上调少突胶质细胞及海马神经元上EPOR 的表达，EPO 与EPOR 结合后磷酸化JAK2，随后激活下游相关信号通路，如：PI3K、STAT5、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）及MAPK家族中的胞外信号调节激酶 （extracellular signal-reg ulated kinases，ERK），这些信号通路的激活能够增强抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-XL 的表达，进而维持线粒体外膜通透性，阻止细胞色素C（Cytochrome C）的释放，最终抑制Caspase-9、Caspase-3 的活化，从而保护细胞免于凋亡[19]。此外，EPO 还具有促神经发生与血管生成的作用，这种作用的产生部分来源于EPO 对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达上调及对VEGF/VEGFR-2 信号通路的激活[20-21]。

3.2 AD

AD 的病理特征是β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ） 在神经元细胞外异常沉积形成的老年斑及tau 蛋白过度磷酸化形成的神经元纤维缠结，临床表现多为认知功能下降及记忆力减退等[22]。AD 是第二大最为常见的神经退行性疾病，其病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元死亡及黑质残存神经元胞质内出现嗜酸性包涵体，即路易小体，其主要成分是α 突触核蛋白[23]，临床表现多为运动迟缓、肌强直及静止性震颤等[24]。尽管两者发病机制不同，但具有相似的演变过程：兴奋性毒性、氧化应激、神经炎症、线粒体功能障碍、神经元死亡和反应性胶质化[21-24]，已证明EPO能够抵抗这些变化从而改善临床症状[25]。

以AD 为例，简要阐述EPO 发挥以上作用的具体表现及部分分子机制[26]（图1）。将PC12、SH-SY5Y 细胞系及海马神经元原代培养物暴露于Aβ 肽或其片段（如Aβ25-35）可引起氧化应激与过度磷酸化的tau蛋白（hyperphosphorylated tau，tau-p）积聚，最终导致细胞凋亡。EPO 能够有效抵抗PC12 细胞及海马神经元原代培养物中Aβ25-35 诱导的氧化应激与谷氨酸诱导的兴奋性毒性造成的线粒体损伤，并上调Bcl-2/Bax 比值，从而抑制Caspase-3 活性与细胞凋亡。在另一项Aβ25-35 诱导的AD 细胞模型中发现，EPO 可以通过PI3K/AKT 途径抑制由tau-p 积聚引起的糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的过度激活，而GSK-3β 可以促进凋亡蛋白的释放[26]。在AD 患者和动物模型中，神经胶质细胞的过度活化是神经炎症和细胞损伤的标志。活化的胶质细胞释放大量炎症细胞因子（如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8）与氧自由基，直接促进细胞凋亡并引发认知功能障碍，而AD 大鼠经体内注射EPO 后，炎症反应减轻，认知功能改善[27]。

图1 EPO 对AD 中Aβ 和tau-p 异常积聚引起的神经损伤的保护作用

3.3 PD

同样已在多种体外及体内PD 模型中观察到EPO的神经保护作用，EPO 可以抑制6-羟基多巴胺诱导的PC12 细胞凋亡及鱼藤酮诱导的SH-SY5Y 细胞凋亡[1]。此外，EPO 对星形胶质细胞、神经元及小胶质细胞的神经保护作用机理并不相同。具体来讲，EPO 通过抑制依赖于MAPK 信号通路的水孔蛋白AQP4 的表达减轻星形胶质细胞肿胀并改善血脑屏障通透性，通过降低磷脂酰丝氨酸受体表达抑制小胶质细胞反应性胶质化并间接抑制神经元凋亡[28]。促红细胞生成素释放神经前体细胞（erythropoietin-releasing neural precursors cells，Er-NPCs） 是心室下区来源的神经前体细胞的一个亚类，它们呈现更高的神经分化。单侧纹状体定向注射Er-NPCs 可以快速起到抗炎作用，其通过调节炎性细胞因子及抗炎细胞因子的表达，直接抵消小胶质细胞的M1 样促炎反应并诱导M2 样促再生作用，分化和挽救退化的多巴胺能神经元，且抗EPO 抗体与Er-NPCs 的共同注射可以中和Er-NPCs的抗炎作用，这表明Er-NPCs 的抗炎活性是由其释放的EPO 介导的[29-30]。最新研究发现，EPO 还可以通过加快糖酵解速率提升细胞内ATP 水平，以挽救线粒体损伤并改善氧化还原失衡和神经炎症，最终抑制多巴胺能神经元变性，恢复其细胞活力[31]。

4 EPO 衍生物的神经保护作用及其机制

考虑到本综述的部分目的在于比较结构与作用方式差异较大的EPO 及其衍生物的神经保护作用与机制，因此本部分主要以pHBSP 作为叙述对象。对于asialo-EPO 与neuro-EPO，尽管两者通过降低唾液酸化水平显著缩短了血浆半衰期，但理论上二者仍可以结合（EPOR）2，多次大剂量的给药依然具有高血压与血栓形成等风险[26]，因此不是理想的神经保护剂。不过值得一提的是，neuro-EPO 通过鼻腔给药的方式似乎完全规避了这种风险，并已在临床试验中显示出有益效果，遗憾的是，目前尚不明确鼻腔给药下neuro-EPO 的药物动力学[11]。CEPO 已被多项研究证明即使在长期给药下也不会产生促红作用，并在多种神经疾病中显示出保护作用[32]。但CEPO 存在生产成本高、结构不稳定及潜在的抗体形成等问题，限制了其在临床治疗中的应用[33]。而pHBSP 作为一段仅与EPOR/βCR 特异性结合的只有11 个氨基酸组成的小分子多肽显然更具优势，包括更容易穿越血脑屏障等，且虽然静脉注射后其血浆半衰期只有几分钟，但仍可以发挥持续的生物学效应，这可能部分依赖于参与其作用机制的相关信号通路[14]（图2），比如持久存活途径PI3K/AKT 的激活可能介导了pHBSP 较长时间的组织保护作用[14]。

图2 pHBSP 的生物活性涉及细胞内多条信号通路

已在体外、体内及临床试验中观察到pHBSP 的神经保护作用且均未观察到高血压与血栓形成等副作用。体外研究表明EPO 可以抑制运动神经元中卡因酸诱导的谷氨酸兴奋性毒性[13]。在癫痫持续状态大鼠模型中，pHBSP 可以促进海马神经元的分化和存活并改善癫痫大鼠的认知缺陷[34]。在一项针对22 名结节病患者的双盲、随机、对照试验中，静脉注射pHBSP第4 周，疼痛强度和小纤维神经病变筛查列表（small fibroneuropathy screening list，SFNSL） 评分显著降低，表明pHBSP 可以减轻结节病患者中的小纤维神经病变[35]。对患有神经病变症状的2 型糖尿病患者皮下注射pHBSP，受试者表现出血红蛋白A1c 和脂质分布的改善，通过PainDetect 调查表评估的神经病理性疼痛也得到了显著降低，表明pHBSP 有助于改善2 型糖尿病患者的代谢控制和神经病变[36]。

5 小结

综上所述，EPO 是一种复杂的多效性细胞因子，其作用取决于细胞类型、给药浓度与生理状况等具体的反应环境。在神经系统中，EPO 以上述环境依赖性的方式结合多种受体并激活相应的信号级联以实现神经保护与神经修复功能。尽管在具体细胞与具体损伤类型中的作用不尽相同，但可以概括地表述为抗氧化、抗炎与抗凋亡，这些共性的作用提示了EPO 在神经退行性疾病中的治疗潜力。为避免促红作用带来的血栓形成等风险，特异性地针对组织保护性受体的EPO衍生物被开发出来，已在神经退行性疾病的动物模型与临床研究中观察到EPO 及其衍生物产生的有益效果。此外，鼻腔给药也是一种可行的途径，其临床限制性主要体现在相关药动学与药效学尚未明确。总之，EPO 具有明显的神经保护作用，对其构效关系与多样性受体的进一步研究促进了非促红EPO 衍生物的开发，进一步阐明了EPO 的神经保护作用机制，同时为多种神经疾病的临床治疗提供了有效的解决方案。