高效液相色谱法测定鸡蛋、鸡肉中五种类胡萝卜素物质

兰 韬，闫 娜,2，裴 栋，刘佳雯,2，于聪聪，初 侨，李笃信

（1.中国标准化研究院，北京 100191；2.苏州大学药学院，江苏苏州 215006；3.青岛市资源化学与新材料研究中心，山东青岛 266000）

斑蝥黄（Canthaxanthin，C40H52O2）又称角黄素，属于类胡萝卜素[1]，可通过家禽消化道吸收并最终富集于蛋黄[2]，是一种较为常用的饲料添加剂。叶黄素、玉米黄素、虾青素、β-胡萝卜素等都属于类胡萝卜素，被广泛用于食品、医药、化妆品、饲料等行业[3−4]。这些色素能提高肉鸡皮肤、脚胫和胴体的颜色，使鸡肉的新鲜度和健康度提高，提高鸡肉制品的附加值[5]。同时这些色素也可以加深蛋黄色泽，有商家就把这种“美容蛋”冒充土鸡蛋，赚取高额差价[6]。2019年“3.15”央视晚会也报道了斑蝥黄染色鸡蛋冒充土鸡蛋的问题，引起了社会的广泛关注[7]。

这些着色剂在低剂量时对人体具有一定的保健作用[8]，但是如果过量摄入可能会对人体造成一定的危害，如斑蝥黄积累会造成视力减退等眼疾[9]，所以欧盟于2003年规定饲料中斑蝥黄的含量为25 mg/kg[10]，联合国粮食及农业组织和世界卫生组织联合食品添加剂专家委员会规定斑蝥黄每日允许摄入量为0.03 mg/kg BW[11]，日本“肯定列表制度”规定禽蛋中斑蝥黄的最大残留限量为0.1 mg/kg[12]，我国也在2018年《饲料添加剂安全使用规范》中规定饲料中斑蝥黄的限量为25 mg/kg[13]。因此，建立禽蛋制品中斑蝥黄等色素含量的检测方法标准以监控色素的使用势在必行。

目前针对天然色素的检测方法主要包括分光光度计法[14]、高效液相色谱法[15−17]、液相色谱-质谱联用法[18−20]等，其中高效液相色谱法分析速度快，普及率高，成为分离此类物质的首选方法。然而玉米黄质和叶黄素两者互为异构体，分离起来比较困难，对其分离仍然是一项挑战[21]。通过查阅文献资料发现，我国针对这些着色剂分别制定了相应的检测方法标准[22−23]，并做了系列研究[24−25]。其中，分析检测主要采用高效液相色谱法（HPLC）。然而这些标准和研究都以饲料或肉为基质，而且基本都是只针对一到两种着色剂进行检测，较少涉及复杂基质中多种色素的同时检测。因此，本文基于HPLC法建立了同时测定鸡蛋、鸡肉等复杂基质中5种类胡萝卜素色素的检测方法。并通过方法学考察，实现方法的标准化，为相关产品的质量控制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡蛋、鸡肉 采购于北京当地超市，将鸡蛋、鸡肉样品冻干后研磨成粉末，保存于−18 ℃冰箱；虾青素（Astaxanthin）、叶黄素（Xanthin）、斑蝥黄（Canthaxanthin）、玉米黄素（Zeaxanthine）、β-胡萝卜素（β-carotene）标准品 保存在4 ℃冰箱，美国Cerilliant公司；乙腈、二氯甲烷、甲醇（色谱纯） 德国默克公司（中国）。

iChrom5100分析型 国产液相色谱仪（配DAD检测器）、Supersil-ODS2色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 大连依利特分析仪器有限公司；Thmorgan-VM200型涡旋振荡器 托摩根生物科技有限公司；HITACHI-CF15RXII离心机 日立公司；Sartorius分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；ELGA纯水仪 北京诚驿恒仪科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 分别准确称取50.0 g（精确到0.001 g）鸡蛋、鸡肉样品，用高速组织捣碎机充分捣碎、混匀，形成鸡蛋、鸡肉样品粉末，装入密封瓶保存。

分别采用两种样品提取净化方法进行了对比和优化，其中方法1具体操作方法为：称取试样约5.0 g（精确至0.001 g）于50 mL离心管中，加入30 mL乙腈提取剂及10 g无水硫酸钠后，涡旋混合1 min，在35 ℃以下水浴超声提取10 min，再以3000 r/min离心5 min。将上清液移入预置有20 mL正己烷的125 mL分液漏斗中，振摇0.5 min后，静置分层；收集下层乙腈相，正己烷相留在分液漏斗，待本试样后续脱脂重复使用。按上述步骤对离心管中的残留物每次用20 mL乙腈提取剂再重复提取两次，所得提取液用上述正己烷相依次脱脂。合并三次脱脂后所收集的乙腈相，加入5 mL正丙醇，于40 ℃以下旋转蒸发浓缩至近干，用乙腈溶解并定容至5.0 mL，0.20 μm滤膜过滤，滤液待测。测定操作应避强光、连续进行。

方法2为QuEChERS方法，分别准确称取5.0 g（精确到0.001 g）鸡蛋、鸡肉样品粉末于50 mL离心管，加入30 mL 60%二氯甲烷/乙腈溶液进行提取，并加入10 g无水硫酸钠，涡旋1 min，35 ℃水浴超声10 min，离心3500 r/min 5 min，过0.22 μm滤膜，得基质溶液。

1.2.2 溶液配制

1.2.2.1 标准储备液 取虾青素、叶黄素、玉米黄素、斑蝥黄、β-胡萝卜素标准品各2 mg，分别溶于1 mL二氯甲烷中，分别制得2 mg/mL的五种类胡萝卜素标准品溶液。分别取500 μL各种类胡萝卜素标准品溶液入10 mL棕色容量瓶，并加入3.5 mL二氯甲烷，并用乙腈定容，得到10 mL 100 μg/mL的混合标准品（60%二氯甲烷/乙腈），4 ℃冰箱冷藏保存，有效期为6个月。

1.2.2.2 标准工作溶液 准确吸取混合标准储备液0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mL分别置于10 mL容量瓶中，用60%二氯甲烷/乙腈溶液定容，配制为质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的系列混合标准工作液，现用现配。

1.2.2.3 基质标准储备溶液 分别取2 mg/mL的虾青素、叶黄素、斑蝥黄、β-胡萝卜素、玉米黄素各500 μL入10 mL棕色容量瓶，以基质溶液定容，得到总体积为10 mL100 μg/mL的基质标准储备溶液，4 ℃冰箱冷藏保存，有效期为6个月。

1.2.2.4 基质标准工作溶液 准确吸取混合标准储备液0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mL分别置于10 mL容量瓶中，用基质溶液定容，配制为质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的系列基质标准工作溶液，现用现配。

1.2.3 液相色谱条件 色谱柱：Supersil-ODS2色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。柱温：30 ℃。进样量：10 μL。流速：1.0 mL/min。检测波长：470 nm。洗脱时间：20 min。流动相分别采用流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸水溶液的体系1；流动相A为乙腈，流动相B为氯仿的体系2；流动相A为乙腈，流动相B为二氯甲烷的体系3这三个体系进行优化。最后选择流动相A为乙腈，流动相B为二氯甲烷（使用前经有机相滤膜抽滤，超声脱气）。梯度洗脱程序：0~13 min，3%B；13~17 min，3%~90%B；17~20 min，90%~3%B。

1.2.4 标准曲线绘制 将配制好的0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg/mL混合标准工作溶液按“1.2.3”的液相色谱条件进样分析，分别以5种化合物的浓度为横坐标，峰面积响应值为纵坐标，绘制系列标准曲线，进行线性回归，得到5种类胡萝卜素的标准曲线线性回归方程。

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 定量限、检出限 将1.2.2.2的标准工作溶液按“1.2.3”的液相色谱条件测定，测得5种类胡萝卜素的峰面积，带入相应物质的标准曲线回归方程中。以最低水平标准溶液中目标组分的3倍平均信噪比为检出限（LOD），10倍平均信噪比为定量限（LOQ），计算得本方法的LOD和LOQ。

1.2.5.2 重复性实验 在相同的仪器条件下，精密称取0.5 g（精确到0.001 g）鸡蛋或鸡肉粉末样品6份，分别加标1.0 μg/mL的混合标准工作液0.5 mL，按“1.2.1” 项下方法操作，将处理好的6份待测液按“1.2.3”色谱条件进样分析，测得5种类胡萝卜素类物质的峰面积，代入标准曲线方程，计算测定浓度的标准偏差RSD。

1.2.5.3 加标回收率 分别准确称取5.0 g（精确到0.001 g）鸡蛋、鸡肉样品粉末各12份于50 mL离心管，编号1~12，其中1~3号作为本底，4~6号加标配成1 mg/kg待测液，7~9号加标配成10 mg/kg待测液，10~12号加标配成20 mg/kg待测液，加入30 mL 60%二氯甲烷/乙腈溶液，并加入10 g无水硫酸钠，涡旋1 min，35 ℃水浴超声10 min，离心3500 r/min 5 min，过0.22 μm滤膜，将处理好的待测液以及低、中、高3种浓度的加标样品经HPLC分析，测得峰面积，计算回收率。

1.2.5.4 基质效应 本研究以“1.2.3”色谱条件对鸡蛋、鸡肉样品不含基质的标准工作溶液标准工作溶液和含基质的标准工作溶液分别进行分析，分别对比鸡蛋、鸡肉样品不含基质的标准工作溶液标准曲线（A1、A2）和含基质的标准工作溶液标准曲线（B1、B2）的斜率。分别计算各目标物的标准曲线方程的斜率比。

1.3 数据处理

本文标准曲线线性回归方程及相关系数由依利特ichrom5100 workstation处理所得，其他数据采用Origin 8.5和Excel 2010软件对数据进行处理并作图，实验数据取3次平行实验的平均值。

2 结果与分析

2.1 前处理方法优化

大多数类胡萝卜素可溶解于大部分有机溶剂中，不溶于水。这五种类胡萝卜素均具有较强的极性，在二氯甲烷中具有较好的溶解度[26]。文献报道丙酮、乙腈、二氯甲烷/乙腈、甲醇/二氯甲烷等极性有机溶剂的提取效果均能满足要求，但用乙腈提取对动物性基体具有可减少脂肪进入提取液的优点[27]。故先采用乙腈提取，正己烷脱脂。但发现样品中类胡萝卜素类物质有损失，回收率较低，所以选择不用正己烷脱脂。又采用纯二氯甲烷提取，发现鸡蛋液漂浮在上方，不易分离以及过滤。因而选择60%二氯甲烷/乙腈溶液进行提取，回收率较好，具有较好的提取效果。两种提取溶剂体系的提取结果如表1所示。同时加无水Na2SO4有助于吸收样品中水分，改善提取效果[28]。

表1 2种不同溶剂提取结果对比Table 1 Comparison of extraction results of two different solvent

2.2 液相色谱条件优化

本实验对比了乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-氯仿和乙腈-二氯甲烷三个流动相体系下，对于5种类胡萝卜素的分离情况，结果如图1所示。从图1中可以看出，乙腈−0.1%甲酸水溶液体系下，由于样品脂溶性较强，析出现象比较严重，有些物质可能已经析出，不利于样品分离。乙腈-氯仿体系分离的各个组分出峰时间较长，分析时间需要40 min左右，分析效率较差。而乙腈-二氯甲烷体系下分离的各个组分出峰较快，峰性尖锐，各物质均得到了较好分离，结果如图1所示，可见在最佳条件下5种类胡萝卜素的分离度良好，在20 min内可完成5种色素的基线分离。故本实验选用乙腈-二氯甲烷作为本实验流动相体系。

图1 三种流动相体系下5种类胡萝卜素的色谱分离图Fig.1 Chromatogram of 5 carotenes under three mobile phase systems

2.3 标准曲线、定量限、检出限

以该方法对5种类胡萝卜素混合标准工作溶液进行测定，以最低水平标准溶液中目标组分的3倍平均信噪比为检出限（LOD），10倍平均信噪比为定量限（LOQ），计算得本方法的LOD和LOQ。其线性范围、相关系数、LOD及LOQ如下表2所示。从表2可以看出，这5种类胡萝卜素在0.5~100 μg/mL线性范围内有较好的线性关系，决定系数R2均>0.996。经计算，5种类胡萝卜素物质的检出限（LOD，S/N=3）均在0.10~0.20 mg/kg之间，定量限（LOQ，S/N=10）均在0.33~0.66 mg/kg之间。

表2 5种类胡萝卜素物质的线性范围、LOD和LOQ Table 2 Linear range, LOD and LOQ of 5 carotenes

2.4 重复性试验

本文对该HPLC方法的重复性进行了考察，在相同的仪器条件下，按照1.2.5.2实验步骤，分别测得平行6组鸡肉和鸡蛋中虾青素、叶黄素、斑蝥黄、β-胡萝卜素、玉米黄素五种物质的浓度及RSD如下表3所示。6次重复试验的浓度RSD均小于5%，说明方法的重复性较好。

表3 方法的重复性试验结果（n=6）Table 3 Repeatability test results of this method(n=6)

2.5 方法的回收率

为了验证方法的可靠性，本文对鸡蛋、鸡肉样品进行加标回收实验，加标水平均为1、10、20 mg/kg的混合标准品，每个加标水平做6次平行实验，经处理后上机分析。方法回收率和精密度列于表4中。对于鸡蛋样品的加标回收试验来说，在3个加标水平下，5种类胡萝卜素的平均回收率在71.6%~112.9%之间，RSD≤6.9%；对于鸡肉样品的加标回收实验来说，在3个加标水平下，5种类胡萝卜素的平均回收率在88.6%~119.7%之间，RSD≤7.2%。该结果表明，本研究建立的检测方法在不同加标水平下，具有较高的回收率和良好的精密度，能够满足多种鸡蛋、鸡肉样品中5种类胡萝卜素类物质检测的要求。

表4 鸡蛋、鸡肉样品的加标回收试验结果Table 4 Recoveries of 5 carotenes in egg and chicken samples

2.6 基质效应

基质效应的存在使得在实际的痕量物质检测过程中，当使用纯溶剂标准曲线进行校准时，常常会引起分析结果的偏差和对样品制备过程回收率的错误估算[29]。对基质效应不明显的样品，其基质标准曲线和溶剂标准曲线基本重合。基质效应为基质匹配校准曲线的斜率与溶剂标准校准曲线的斜率两者之比，比值越接近1，则基质效应越小[30−31]。本研究通过分别对比鸡蛋、鸡肉样品不含基质的标准工作溶液标准曲线（A）和含基质的标准工作溶液标准曲线（B）的斜率，以表征5种色素的基质效应，结果见表5。结果表明，鸡蛋样品中，虾青素、叶黄素、玉米黄素和斑蝥黄的基质效应不明显，β-胡萝卜素存在一定的基质增强效应；鸡肉样品中，叶黄素和玉米黄素的基质效应不明显，虾青素、斑蝥黄和β-胡萝卜素存在明显的基质减弱效应，综上所述，鸡蛋、鸡肉样品均需要基于基质溶液进行实验。所以后续实验均基于基质溶液进行。

表5 鸡蛋、鸡肉样品的基质效应Table 5 Matrix effect of egg and chicken samples

2.7 实际样品测定

以本方法的提取工艺和色谱条件对市售的鸡蛋和鸡肉样品中的五种类胡萝卜素类物质进行了分离分析，各物质含量的计算结果如表6所示。实际样品分析结果表明，鸡蛋和鸡肉中均有五种类胡萝卜素类物质检出，但是含量都较少，其中有部分鸡蛋和鸡肉样品检出斑蝥黄，可能存在一定斑蝥黄添加剂饲喂的现象，但是检出量较低，未超过标准规定的限值。说明我国在相关饲料添加剂的使用方面管控较严。

表6 不同鸡蛋鸡肉样品中5种类胡萝卜素含量Table 6 Contents of 5 carotenes in egg and chicken samples

3 结论

本文借鉴了QuEChERS净化方法，基于鸡蛋、鸡肉和五种类胡萝卜素类物质的特性，对基质的提取净化方法以及目标物的检测方法进行了优化，建立了鸡蛋、鸡肉中五种类胡萝卜素的HPLC检测方法，使一次性同时检测复杂基质中5种主要类胡萝卜素的含量成为可能。该方法对5种类胡萝卜素在0.5~100 μg/mL线性范围内有较好的线性关系，决定系数R2均大于0.996，方法的检出限均在0.10~0.20 mg/kg之间，定量限在0.33~0.66 mg/kg之间。在1、10、20 mg/kg的加标水平下，鸡蛋和鸡肉样品的加标回收率分别在71.6%~112.9%和88.6%~119.7%之间，RSD≤7.2%。该方法具有定量准确、操作简便、省时省力的优点，可用于色素饲喂的土鸡蛋、鸡肉的真伪鉴别，降低检测机构和企业的检测成本，促进市场监管的便利化。