提取方法对银杏蛋白功能特性及抗氧化活性的影响

李诗颖，陈 琳，糜心怡，梁一凡，李 闯，郑 义,2,

（1.徐州工程学院食品与生物工程学院，江苏徐州 221018；2.江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏徐州 221018）

银杏（Ginkgo biloba）为银杏科银杏属植物，是我国特有的中生代孑遗树种。银杏种仁（白果）为卫计委认定的药食同源物质，具有益气、润肺和定喘等功能。银杏营养成分丰富，干制品中蛋白含量13.2%，碳水化合物含量72.6%，粗脂肪含量1.3%，此外还含有丰富的维生素E及多种矿质元素[1]。银杏蛋白以清蛋白和球蛋白为主，氨基酸组成合理，必需氨基酸占比高，属于优质植物蛋白[2]。邓乾春等研究表明，银杏白蛋白具有较好的清除超氧阴离子和拮抗DNA氧化损伤的活性[3]，银杏清蛋白可通过免疫调节和抗氧化能力发挥对衰老小鼠、免疫抑制小鼠和S180肿瘤小鼠的保护作用[4−6]。

植物蛋白的提取有物理压榨和溶剂浸提法等，其中溶剂浸提法是最常使用的方法。溶剂浸提法主要有水提酸沉法（water extraction and acid precipitation,WEAP）、碱提酸沉法（alkali extraction and acid precipitation, AEAP）和盐提盐析法，以及各种辅助提取技术，如超声辅助提取、微波辅助提取、酶辅助提取、反胶团萃取和双水相萃取等。目前已有数篇关于银杏蛋白提取工艺的研究报道，李盼盼等优化了银杏蛋白超声辅助提取的工艺参数[7]，贾韶千等报道了银杏蛋白碱法提取的最佳工艺[8]，陈西娟考察了银杏蛋白的盐提盐析法的工艺条件[9]。研究表明功能活性物质的结构、理化性质和生物活性会受到提取方法的影响[10−12]。彭倩等发现碱提酸沉法和盐溶法提取的腰果蛋白的结构和功能特性具有显著性差异[13]。职士淇等研究表明超声辅助碱提、盐提和水提制备的青叶苎麻叶蛋白质的功能特性各有优劣[14]。有关提取方法对银杏蛋白功能特性和抗氧化活性的研究未见报道。

本研究采用WEAP、AEAP和超声辅助碱提酸沉法（ultrasound-assisted alkali extraction and acid precipitation, UA-AEAP）三种方法制备银杏蛋白，考察提取方法对银杏蛋白溶解度、起泡性、起泡稳定性、乳化性和乳化稳定性等功能特性的影响，同时考察提取方法对银杏蛋白螯合亚铁离子能力、清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH）自由基能力和清除羟基自由基能力的影响，旨在为银杏蛋白资源的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜银杏 2020年10月采自江苏邳州；牛血清白蛋白、DPPH、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）、菲啰嗪 美国Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为国产分析纯。

FA2104N电子分析天平、723C可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；K9840自动凯氏定氮仪 济南海能仪器股份有限公司；LGJ-18A冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；TGL-16G型台式离心机 上海安亭科学仪器厂；SHZ-D（Ш)循环水式真空泵 郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 新鲜银杏去外种皮、脱壳后，60 ℃下烘干至恒重，粉碎过60目，加入4倍体积石油醚，浸泡24 h脱脂，得到脱脂银杏粉。

1.2.2 银杏蛋白的制备 根据预实验结果确定了不同提取方法的工艺参数。WEAP提取条件：取50 g脱脂银杏粉，按液料比20:1 mL/g分别加入去离子水，提取温度60 ℃，提取时间2 h。AEAP提取条件：按液料比20:1 mL/g将脱脂银杏粉与NaOH溶液混合，调pH10.0，提取温度60 ℃，提取时间2 h。UA-AEAP工艺参数：液料比20:1 mL/g，超声功率200 W，超声处理时间20 min，提取温度60 ℃，提取时间40 min。提取后，3500 r/min离心20 min，收集上清液，调pH至银杏蛋白的等电点4.4，4500 r/min离心20 min，所得沉淀透析（截留相对分子质量3500 Da）72 h，浓缩，冷冻干燥，得银杏蛋白。

1.2.3 银杏蛋白得率及其化学成分的测定 蛋白含量的测定：GB 50095-2016凯氏定氮法；总糖含量的测定：苯酚硫酸法；粗脂肪含量的测定[15]：5009.6-2016索氏抽提法；灰分含量的测定：GB 5009.4-2016重量分析法。

银杏蛋白得率计算公式如下：

1.2.4 银杏蛋白溶解度的测定 将100 mg银杏蛋白溶于20 mL去离子水中，调pH为2~12，室温下搅拌30 min，4500 r/min离心20 min，收集上清液。考马斯亮蓝法测定上清液中银杏蛋白的含量。

1.2.5 起泡性和泡沫稳定性的测定 取500 mg银杏蛋白分散于15 mL 0.01 mol·L−1磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）中，记录初始体积为V1（mL），10000 r/min均质2 min，记录泡沫体积为V2（mL），静置30 min记录体积记为V3（mL）。银杏蛋白起泡性和泡沫稳定性的计算公式如下：

1.2.6 乳化性和乳化稳定性的测定 取200 mg银杏蛋白分散于20 mL 0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）中，室温下搅拌30 min，加入5 mL大豆油，10000 r/min均质2 min。吸取100 μL乳液，加入5 mL SDS，混匀，测定500 nm处的吸光度。银杏蛋白乳化性和乳化稳定性的计算公式如下：

式中：N为稀释倍数；A1和A2分别为0和30 min时的吸光度；c为蛋白浓度，g/mL；θ为乳液中油相体积分数；Δt为两次吸光度测定的间隔时间，min。

1.2.7 亚铁离子螯合能力测定 采用Decker报道的方法[16]，并稍加修改。将1 mL银杏蛋白溶液（0.01~10 g/L）与3.7 mL 55%（v/v)乙醇、0.1 mL氯化亚铁（2 mmol/L）和0.2 mL菲啰嗪（5 mmol/L）混匀，静置20 min，测定562 nm处的吸光度。55%乙醇代替样液作为空白对照。EDTA（0.01~10 g/L）作为阳性对照。亚铁离子螯合率计算公式如下：

式中：Ab和As分别为空白对照组和样品组的吸光度。

1.2.8 DPPH自由基清除能力测定 参考Wu等报道的方法[17]。取1.5 mL银杏蛋白溶液（0.1~6 g/L），加入1.5 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L），混匀，室温下置于暗处30 min，测定517 nm处的吸光度。抗坏血酸（0.05~4 g/L）做阳性对照。

式中：Ac为1.5 mL蒸馏水与1.5 mL DPPH混合液的吸光度；As为1.5 mL样液与1.5 mL DPPH混合液的吸光度；Ab为1.5 mL样液与1.5 mL 95%乙醇混合液的吸光度。

1.2.9 羟基自由基清除能力测定 采用邻菲罗啉分光光度法[18]。银杏蛋白质量浓度为0.1~10 g/L，抗坏血酸（0.1~10 g/L）做阳性对照，测定536 nm处的吸光度。损伤组：取0.5 mL邻菲罗啉（0.75 mmol/L），加入1 mL磷酸盐缓冲液（0.15 mmol/L，pH7.4）和0.5 mL去离子水，混匀后加入0.5 mL 0.75 mmol/L FeSO4，0.5 mL 0.01% H2O2，37 ℃水浴60 min，测吸光度记为Ad。未损伤组：以0.5 mL去离子水代替0.01% H2O2，其他条件同损伤组，测吸光度记为Au。样品组：以0.5 mL样液代替0.5 mL去离子水，其他条件同损伤组，测吸光度记为As。样品参比组：以0.5 mL去离子水代替0.5 mL邻菲罗啉，其他条件同样品组，测吸光度记为Ar。空白参比组：以0.5 mL去离子水代替0.5 mL样液，其他条件同样品参比组，测吸光度记为Ab。

式中：Ab、Ad、Ar、As和Au分别为空白对照组、损伤组、样品参比、样品组和未损伤组的吸光度。

1.3 数据处理

每组实验重复3次，结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 24.0软件进行方差分析，组间多重比较采用Duncan法。

2 结果与分析

2.1 对银杏蛋白得率和蛋白制品中化学成分的影响

表1 为提取方法对银杏蛋白得率和蛋白制品中化学成分的影响。由表1可知，不同提取方法制备的银杏蛋白得率存在显著性差异（P<0.05），其中UA-AEAP蛋白得率最高，达到了11.36%±0.10%。不同提取方法制备的银杏蛋白产品中蛋白、总糖、粗脂肪和灰分含量均无显著性差异（P>0.05）。三种方法制备的银杏蛋白纯度均可以满足功能特性分析的需要。UA-AEAP蛋白得率高，提取时间短，更加适用于银杏蛋白的制备。

表1 提取方法对银杏蛋白得率和蛋白产品中化学成分的影响Table 1 Effects of extraction methods on the yield of Ginkgo biloba proteins and the chemical components in the products

2.2 对银杏蛋白溶解度的影响

溶解度是蛋白质的重要功能特性之一，乳化性、起泡性、起泡稳定性等其他功能特性与溶解度密切相关[19]。图1为不同提取方法对不同pH下银杏蛋白溶解度的影响。由图1可知，随着pH的增大，三种提取方法制备的银杏蛋白的溶解度均先降低后升高，溶解度在pH4.0左右都达到了最小值，这与李向阳等[20]报道的银杏蛋白在等电点处的溶解度最低相一致。在pH2~12的范围内，UA-AEAP银杏蛋白的溶解度最高，WEAP蛋白的溶解度略高于AEAP蛋白。结果提示，超声处理可提高银杏蛋白的溶解度，可能的原因是超声处理产生的空化效应可以降低蛋白质颗粒聚集体的粒度。这与前人研究结果一致，超声处理可显著提高大豆亲脂蛋白[21]、鹰嘴豆分离蛋白[22]和Oleosin蛋白[23]的溶解度。

图1 提取方法对不同pH下银杏蛋白溶解度的影响Fig.1 Effects of extraction methods on the solubility of Ginkgo biloba proteins at different pH

2.3 对银杏蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响

起泡性和泡沫稳定性是蛋白质应用于食品加工中最重要的功能特性之一，前者主要取决于蛋白质溶液的溶解度、疏水基团的数目和肽链的柔韧性等因素，而后者主要取决于蛋白质溶液的流变学性质[24]。图2为不同提取方法对银杏蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响。由图2可知，UA-AEAP蛋白的起泡性和泡沫稳定性显著高于AEAP蛋白和WEAP蛋白（P<0.05），可能的原因是超声产生的空化效应降低了银杏蛋白颗粒聚集体的粒度，同时降低水的界面张力，有利于蛋白分子的快速扩散[25]。AEAP蛋白的起泡性显著低于WEAP蛋白，但泡沫稳定性显著高于WEAP蛋白（P<0.05），可能的原因是水提法溶液的pH更接近蛋白的等电点，被吸附到界面上的蛋白数量增加，从而提高了蛋白的起泡性[26]。

图2 提取方法对银杏蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响Fig.2 Effects of extraction methods on the foaming capacity and foam stability of Ginkgo biloba proteins

2.4 对银杏蛋白乳化性和乳化稳定性的影响

蛋白质的乳化性能在食品加工中具有重要的意义，主要受到疏水基因的数目、界面张力等因素影响。图3为提取方法对银杏蛋白乳化性和乳化稳定性的影响。由图3可知，UA-AEAP蛋白的乳化性显著高于AEAP蛋白和WEAP蛋白（P<0.05），可能的原因是超声处理增加了银杏蛋白的溶解度，抑制蛋白聚集，提高乳液界面吸附蛋白能力[25]。WEAP蛋白的乳化性显著高于AEAP蛋白（P<0.05），可能是因为WEAP蛋白具有更高的溶解度。三种银杏蛋白的乳化稳定性无显著性差异（P>0.05）。

图3 提取方法对银杏蛋白乳化性和乳化稳定性的影响Fig.3 Effects of extraction methods on the emulsifying capacity and emulsion stability of Ginkgo biloba proteins

2.5 对银杏蛋白螯合亚铁离子能力的影响

亚铁离子等过渡态金属离子可催化机体中的Fenton反应，引发脂质过氧化并产生羟基自由基，螯合亚铁离子能力是评估受试物抗氧化活性的常用方法之一[27]。不同提取方法对银杏蛋白螯合亚铁离子能力的影响如图4所示。三种银杏蛋白均表现出较好的亚铁离子螯合能力，且与质量浓度呈正相关。在质量浓度为2.0 g/L时，WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白对亚铁离子的螯合率分别为21.78%±0.78%、12.92%±0.46%和18.78%±0.58%，而质量浓度增加至8.0 g/L时，螯合率分别提高到68.54%±3.01%、67.68%±3.21%和73.28%±3.45%。在低质量浓度时，三种银杏蛋白对亚铁离子螯合能力的顺序为WEAP>UA-AEAP>AEAP；而当质量浓度超过3.0 g/L时，UA-AEAP的螯合能力则高于WEAP和AEAP。银杏蛋白对亚铁离子的螯合能力可能是因为氨基酸残基中的羧基等基团与亚铁离子发生了配位反应。UA-AEAP蛋白具有更强的亚铁离子螯合能力，可能是因为超声处理能够降低银杏蛋白聚集体的粒度，暴露出更多功能基团[28]。许晶等研究表明，超声预处理也可显著提高大豆蛋白对亚铁离子的螯合能力[29]。

图4 提取方法对银杏蛋白螯合铁离子能力的影响Fig.4 Effects of extraction methods on the chelating ability against ferrous ions of Ginkgo biloba proteins

某种受试物的IC50低于10 g/L，则说明该受试物具有一定的抗氧化能力[30]。利用Origin 2018对图4数据进行非线性曲线拟合，得到WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白对DPPH自由基清除能力的对数曲线方程分别为y=−31.56+43.32 ln（x+0.1.63），R2=0.9735，y=−57.88+53.008 ln（x+2.15），R2=0.9719和y=−16.92+41.33 ln（x+0.73），R2=0.9662。根据R2可知，拟合优度较好，由上述方程计算得出WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白对亚铁离子螯合能力的IC50分别为4.94、5.48和4.32 g/L。由IC50可知，三种银杏蛋白对亚铁离子的螯合能力顺序为UAAEAP>WEAP>AEAP。阳性对照的IC50为0.09 g/L，提示EDTA具有极强的螯合亚铁离子的能力。

2.6 对银杏蛋白清除DPPH自由基能力的影响

DPPH自由基清除能力是评估受试物抗氧化潜力的最常用方法之一，当DPPH自由基被受试物清除时，DPPH溶液的吸光度会降低，因此可用于评估受试物的清除自由基能力[31]。不同提取方法对银杏蛋白清除DPPH自由基能力的影响如图5所示。在0.05~6 g/L的质量浓度范围内，三种银杏蛋白的DPPH自由基清除率均与质量浓度呈正相关。当质量浓度为1 g/L时，WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白对DPPH自由基的清除率分别为42.61%±2.14%、41.63%±3.23%和50.47%±1.95%；当质量浓度升高至为5 g/L时，清除率分别提高到70.45%±2.36%、68.78%±2.56%和74.92%±2.28%。与WEAP和AEAP蛋白相比，UA-AEAP蛋白具有更强的DPPH自由基清除能力，可能的原因是超声处理能降低银杏蛋白的聚集度，暴露出更多的与自由基作用的基团。Ma等研究表明，超声处理可提高β-乳球蛋白对DPPH自由基的清除能力[32]，这与本研究的结果相一致。

图5 提取方法对银杏蛋白清除DPPH自由基能力的影响Fig.5 Effects of extraction methods on the DPPH radical scavenging activity of Ginkgo biloba proteins

WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白对DPPH自由基清除能力的对数曲线方程分别为y=37.69+19.31 ln（x+0.11），R2=0.9931，y=34.36+19.86 ln（x+0.15），R2=0.9911和y=45.54+17.79 ln（x+0.04），R2=0.9954。由上述方程计算得出WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白对DPPH自由基能力的IC50分别为1.78、2.05和1.24 g/L，表明这三种银杏蛋白均具有较高的清除DPPH自由基能力，清除能力顺序为UAAEAP>WEAP>AEAP。抗坏血酸的IC50为0.08 g/L，提示抗坏血酸具有极强的清除DPPH自由基能力。

2.7 对银杏蛋白清除羟基自由基能力的影响

羟基自由基被认为是目前已知的氧化能力最强和危害性最大的活性氧之一，可通过电子转移、加成和脱氢作用攻击机体内多种生物分子，从而导致蛋白质、核酸和脂质的氧化损伤[33]。图6为不同提取方法对银杏蛋白清除羟基自由基能力的影响。由图可知，WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白对羟基自由基的清除活性与蛋白质量浓度呈正相关。在质量浓度为1.0 g/L时，WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白对羟基的清除率分别为25.5%±0.82%、22.56%±0.74%和28.62%±1.21%；当质量浓度增加至8.0 g/L时，清除率分别为73.96%±2.73%、68.52%±2.64%和78.94%±2.95%。由此可知，UA-AEAP蛋白具有更强的羟基自由基清除能力，这与前人研究结果相一致，大豆球蛋白经超声预处理后对羟基自由基的清除能力显著增强[29]。银杏蛋白对羟基自由基的清除能力可能是因为氨基酸残基中的羧基等基团通过螯合亚铁离子而阻断Fenton反应，从而降低羟基自由基的产生。

图6 提取方法对银杏蛋白清除羟基自由基能力的影响Fig.6 Effects of extraction methods on thehydroxyl radical scavenging activity of Ginkgo biloba proteins

WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白对羟基自由基清除能力的对数曲线方程分别为y=10.25+28.13 ln（x+0.80），R2=0.9944，y=6.01+27.64 ln（x+0.79），R2=0.9946和y=17.76+27.40 ln（x+0.49）,R2=0.9904，计算出IC50分别为3.31、4.12和2.76 g/L，由此可知，三种银杏蛋白对羟基自由基清除能力的顺序为UA-AEAP>WEAP>AEAP。抗坏血酸的IC50为0.80 g/L，表明抗坏血酸具有极强的清除羟基自由基能力。

3 结论

不同提取方法对银杏蛋白得率的影响较大，其中UA-AEAP蛋白得率最高，达11.36%±0.10%，显著高于WEAP和AEAP。三种提取方法制备的银杏蛋白纯度均较高，可以满足功能特性分析的需要。银杏蛋白溶解度受到提取方法的影响，UA-AEAP蛋白的溶解度最高，WEAP蛋白的溶解度略高于AEAP蛋白。提取方法显著影响了银杏蛋白的起泡性、泡沫稳定性和乳化性等功能特性，而对乳化稳定性无显著性影响；UA-AEAP蛋白的起泡性、泡沫稳定性和乳化性均优于AEAP和WEAP蛋白。提取方法影响了银杏蛋白的抗氧化活性，银杏蛋白的螯合亚铁离子能力、清除DPPH自由基能力和清除羟基自由基能力的顺序均为：UA-AEAP>WEAP>AEAP。综上所述，UA-AEAP蛋白得率高、抗氧化能力和功能特性优于另外两种方法，更适于银杏蛋白的制备。本研究考察了提取方法对银杏蛋白功能特性及抗氧化活性的影响，为银杏蛋白在食品体系中的应用及功能性产品的开发提供了理论基础，后续将进一步研究不同提取方法对银杏蛋白氨基酸组成、二级结构、亚基组成、分子构象等结构的影响。