花生肽亚铁稳定性及胃肠仿生消化行为研究

肖怀秋，李玉珍，林亲录，赵谋明，刘 军，周 全，姜明姣

(1.湖南化工职业技术学院 制药与生物工程学院，湖南 株洲 412000； 2.华南理工大学 食品科学与工程学院，广州 510640；3.中南林业科技大学 食品科学与工程学院，长沙 410004； 4.湖南中威制药有限公司，湖南 株洲 412000)

亚铁(Fe2+)是含铁蛋白(酶)的关键组分，在生物体氧运输、生物大分子合成、生物氧化、髓磷脂生成、神经元树状结构发育、细胞增殖与分化以及基因表达等生理过程有重要作用[1-2]。Fe2+含量不足时易引发缺铁性贫血(IDA)，以及帕金森病、阿尔兹海默病等神经退行性疾病，缺铁严重时会导致细胞色素和含铁酶活性降低，供氧不足，电子传递和能量代谢过程紊乱，机体免疫功能下降和生长发育迟缓等代谢疾病，但可通过食物或药物进行补充。食物中大部分以高铁(Fe3+)形式存在，吸收效率低，只有以亚铁形式存在时，生物利用率才高且结构更稳定，易被人体胃肠道消化、吸收和转运；药物补充主要以无机铁盐或简单有机酸铁盐形式进行，存在稳定性差、胃肠刺激大、易受肠内容物干扰、生物利用率低和存在一定毒副作用等缺陷，补充效果不理想[3]。生物多肽与亚铁经配位螯合后可明显改善亚铁吸收利用率和稳定性，并能减少金属元素间拮抗[4]。多肽结构中的氢键、表面配位键及动态共价键等可与亚铁螯合，并能以完整多肽被肠上皮细胞吸收，经门静脉进入肝脏代谢利用，是制备亚铁营养补充剂的重要新策略，具有吸收率高、毒副作用少和安全边际高等优点[5]。

花生肽亚铁作为亚铁营养补充剂常采用口服给药方式，其在人体胃肠道的消化行为及降解规律是亟待研究的问题。食物的人胃肠仿生消化行为可采取胃肠仿生系统进行体外模拟，利用消化酶模拟人体内的消化进程，可快速、简单、直观地对消化过程进行研究，具有消化用时短、成本低、重现性好等优势[6]。目前，体外模拟消化以两步胃肠消化较常见[7-9]，双酶三阶段法研究较为鲜见。张凯等[10]利用体外胃肠模拟消化系统考察了产物在胃肠道环境中螯合率的变化情况；杜芬等[7]用胃肠仿生消化手段研究并评价了鳕鱼皮胶原蛋白源金属螯合肽(多肽M)的胃肠消化耐受性，认为多肽M体外模拟胃肠消化耐受性高；Sangsawad等[11]研究了鸡胸肽的体外胃肠模拟消化，研究认为1.0 kDa多肽具有更好的生物活性，更容易穿透结直肠单层腺癌细胞。为了客观地评价花生肽亚铁的胃肠仿生消化过程和阐明花生肽亚铁的胃肠消化耐受性，本研究将肠道仿生消化细分为十二指肠消化和小肠消化，采用双酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶)三阶段(模拟人胃-十二指肠-小肠消化)法研究花生肽亚铁在人胃肠仿生条件下的消化行为，明晰花生肽亚铁的胃肠仿生消化行为及消化降解规律，为花生肽亚铁营养补充剂的口服制剂提供理论与技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

花生肽，自制；胃蛋白酶(5 500 U/g)、胰蛋白酶(3 500 U/g)，诺维信(中国)生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

DK-98-11A型电热恒温水浴箱；UV-2500紫外可见分光光度计，日本岛津；TAS990原子吸收光谱；IRPrestige-21岛津傅里叶变换红外光谱仪；HERMLE Z323K冷冻离心机，德国Hermle公司。

1.2 试验方法

1.2.1 花生肽亚铁的制备

以不同相对分子质量(<1.0 kDa、1.0～3.0 kDa和>3.0 kDa)的花生肽为载体，以氯化亚铁为金属螯合配体，在多肽与亚铁质量比4.31∶1、温度25.4℃和pH 7.5条件下螯合28.5 min后，用无水乙醇沉淀，静置2 h并于8 000 r/min离心20 min，得到花生肽亚铁配位螯合物(沉淀部分)，简称为花生肽亚铁(PPC)[5，12]。以相对分子质量小于1.0 kDa、1.0～3.0 kDa、大于3.0 kDa的花生肽为载体制备的花生肽亚铁分别命名为L-PPC、M-PPC和H-PPC。

1.2.2 花生肽亚铁的pH稳定性

准确称取花生肽亚铁配制10.0 mg/L的花生肽亚铁溶液，用0.5 mol/L的HCl或NaOH调节溶液pH至1.0～13.0，于37℃保温1 h，8 000 r/min离心20 min，取上清液测定铁含量，计算花生肽亚铁螯合率。

1.2.3 花生肽亚铁的热稳定性

准确称取花生肽亚铁配制10.0 mg/L的花生肽亚铁溶液(pH自然)，于10～100℃下保温1 h，8 000 r/min离心20 min，取上清液测定铁含量，计算花生肽亚铁螯合率。

1.2.4 模拟胃肠仿生消化液的配制

1.2.4.1 胃仿生消化液

参考《中国药典》(2010版)第二部附录XA方法配制[13]。移取23.4 mL浓HCl，加水100 mL配制成稀HCl溶液，取稀HCl溶液1.64 mL加入80.0 mL去离子水，加入胃蛋白酶1.0 g混匀，加水稀释至100.0 mL即为模拟胃仿生消化液，pH为2.0左右。

1.2.4.2 肠仿生消化液

参考《中国药典》(2010版)第二部附录XVD方法配制[13]。称取0.68 g KH2PO4，用去离子水50.0 mL溶解，调节pH至7.6，另取胰蛋白酶1.0 g于适量水溶解，合并上述溶液并加水稀释至100.0 mL，即为模拟十二指肠仿生消化液。将pH调节到6.8即为模拟小肠仿生消化液。

所有模拟胃肠仿生消化液均现配现用。

1.2.5 花生肽亚铁的人胃肠仿生消化过程

人胃肠仿生消化参考Cruz-Huerta等[14]方法并作修改。采用双酶三阶段法进行连续人胃肠仿生消化，分为胃仿生消化、十二指肠仿生消化和小肠仿生消化。具体仿生消化过程为：准确称取1.0 mg花生肽亚铁加入至100.0 mL胃仿生消化液中，于(37±0.5)℃和100 r/min条件下进行胃仿生消化2 h，每间隔30 min取样，收集的样品命名为SGF1～SGF4(分别对应消化30、60、90、120 min)。胃仿生消化完成后，用0.5 mol/L NaOH调pH至7.6，终止胃仿生消化，8 000 r/min离心20 min，收集沉淀。沉淀用十二指肠仿生消化液溶解并于(37±0.5)℃和50 r/min条件下十二指肠仿生消化1 h，每间隔30 min取样，收集的样品命名SDF1、SDF2(分别对应消化30、60 min)。十二指肠仿生消化完成后，调pH至6.8，继续在(37±0.5)℃、50 r/min条件下仿生小肠消化3 h，每间隔30 min取样，收集的样品命名SIF1～SIF6 (分别对应消化30、60、90、120、150、180 min)。

1.2.6 花生肽亚铁螯合率的测定

采用改进的乙醇沉淀法[7,10,15]测定花生肽亚铁螯合率。取待测样2.00 mL，加入8.00 mL无水乙醇混匀，静置2 h后于8 000 r/min离心20 min，去除沉淀后将上清液浓缩至2 mL，加入8倍体积的无水乙醇，静置2 h后8 000 r/min离心20 min，测定上清液中亚铁含量，铁含量采取邻菲罗琳510 nm比色法[12]测定，样品总铁含量采用GB 5009.90—2016火焰原子吸收光谱法测定。按下式计算亚铁螯合率。

式中：M1为2 mL待测样对应的花生肽亚铁所含的铁含量，mg；M2为上清液中游离亚铁含量，mg。

1.2.7 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 花生肽亚铁的pH稳定性(见图1)

注：图中字母相同表示3种PPC的亚铁螯合率差异不显著(p>0.05)，字母不同表示差异极显著(p<0.01)，下同。

由图1可看出：L-PPC比M-PPC和H-PPC具有更好的pH稳定性，在pH 1～9范围内能保持较好的稳定性，与M-PPC和H-PPC有极显著差异；pH为10.0时，L-PPC亚铁螯合率小于60%，随着pH的进一步增加，亚铁螯合率呈递减趋势。相同pH条件下，H-PPC稳定性最差，主要是由于H-PPC配位螯合载体为大于3.0 kDa的花生肽，相对分子质量较大。研究认为，花生肽亚铁pH稳定性与载体相对分子质量成反比，低相对分子质量载体制备的花生肽具有更好的稳定性。H-PPC在极端pH条件下(如pH<2和pH>9)，亚铁螯合率不足50%，主要是由于相对分子质量大的多肽载体在酸性或碱性条件下易发生分解，从而使已螯合的亚铁离子由共价结合态转变为游离态[16]。L-PPC在酸性条件下具有较好的稳定性，仍保持较高的亚铁螯合率，意味着L-PPC具有较好的酸耐受性。

2.2 花生肽亚铁的热稳定性(见图2)

图2 花生肽亚铁的热稳定性

由图2可以看出，60℃以下L-PPC亚铁螯合率可保持80%以上，M-PPC在50℃以下可保持75%以上的亚铁螯合率，与L-PPC差异不显著，而与H-PPC有极显著差异。当温度达70℃以上，L-PPC、M-PPC和H-PPC的亚铁螯合率均显著下降，且随着温度上升，亚铁螯合率呈线性下降。作为花生肽亚铁金属营养补充剂的口服制剂，以低温或常温储存较为普遍，因此60℃以下能保持较好的稳定性，基本上可满足生产技术要求[17-18]。从L-PPC、M-PPC和H-PPC的热耐受性来看，低相对分子质量载体制备的花生肽亚铁具有更好的热耐受性。在60℃时，L-PPC亚铁螯合率仍保持在(80.65±1.02)%，而H-PPC在37℃时亚铁螯合率仅为(54.38±0.95)%。随着温度的持续上升，H-PPC 的亚铁螯合率呈显著下降趋势，特别是在温度高于50℃后，其亚铁螯合率低于50%。说明对于H-PPC 来说，温度的持续上升使超过50%的结合态亚铁由于多肽链的破坏而变为游离的亚铁离子[19]，主要是由于多肽载体相对分子质量较大时热稳定性较差，特别当温度较高时，容易引起多肽载体的热沉凝聚[10]，亚铁螯合率相应显著降低。

2.3 花生肽亚铁胃仿生消化耐受性(见图3)

图3 花生肽亚铁胃仿生消化耐受性

由图3可以看出，不同相对分子质量载体制备的花生肽亚铁表现出不同的胃酸耐受性。在胃仿生消化30 min时，L-PPC和M-PPC亚铁螯合率差异不显著，亚铁螯合率分别为(89.50±0.70)%和(89.01±0.66)%，但与H-PPC亚铁螯合率((72.74±0.68)%)差异极显著。随着胃仿生消化时间的延长，L-PPC、M-PPC和H-PPC表现的胃酸耐受性呈现极显著性差异。胃仿生消化90 min和120 min时，M-PPC和H-PPC的亚铁螯合率分别为(71.83±1.32)%、(56.61±1.16)%和(61.46±1.25)%和(53.90±1.33)%。胃仿生消化120 min时，相对于胃仿生消化30 min，L-PPC、M-PPC和H-PPC的亚铁螯合率残存率分别为91.15%、69.05%和74.10%。因此，L-PPC胃酸耐受性明显高于M-PPC和H-PPC，与前述的pH稳定性结果一致。主要是由于L-PPC的载体相对分子质量较小，具有较好的稳定性，而相对分子质量较大的载体则稳定性较差[7]。

2.4 花生肽亚铁肠仿生消化耐受性(见图4)

由图4可看出，L-PPC与M-PPC和H-PPC的亚铁螯合率在十二指肠仿生消化和小肠仿生消化过程中均存在极显著差异，其中L-PPC肠耐受性最好。L-PPC在十二指肠仿生消化阶段，亚铁螯合率保持在75%以上，而M-PPC和H-PPC经十二指肠仿生消化60 min，亚铁螯合率分别下降至(57.93±0.83)%和(45.65±0.87)%。在小肠仿生消化阶段，L-PPC亚铁螯合率呈小幅下降，小肠仿生消化180 min，亚铁螯合率为(66.96±1.73)%，而M-PPC降至(38.42±0.85)%，H-PPC肠耐受性最差，小肠仿生消化180 min，其亚铁螯合率仅为(18.34±0.72)%。主要是由于H-PPC载体在小肠仿生消化时遭到破坏，使共价结合的亚铁变成游离态的亚铁[20]。

3 结 论

本试验分别以小于1.0 kDa、1.0～3.0 kDa和大于3.0 kDa的花生肽为载体，以氯化亚铁为配体，采用液相合成法制备L-PPC、M-PPC和H-PPC，研究了其pH、热稳定性和胃肠消化耐受性。研究表明：L-PPC具有较好的pH稳定性和酸耐受性，与M-PPC 和H-PPC存在极显著差异，H-PPC的pH稳定性最差；L-PPC具良好热稳定性，60℃条件下亚铁螯合率仍保持在(80.65±1.02)%，H-PPC在37℃时亚铁螯合率仅有(54.38±0.95)%；胃仿生消化30 min，L-PPC和M-PPC亚铁螯合率差异不显著，与H-PPC差异极显著，L-PPC胃酸耐受性明显高于M-PPC和H-PPC；在十二指肠仿生消化阶段，L-PPC亚铁螯合率与M-PPC和H-PPC亚铁螯合率差异极显著；在小肠仿生消化阶段，L-PPC 仿生消化180 min，亚铁螯合率为(66.96±1.73)%，而M-PPC降至(38.42±0.85)%，H-PPC肠耐受性最差。研究结果说明，低相对分子质量载体制备的花生肽亚铁具有更好的pH稳定性、热耐受性和胃肠消化耐受性，经胃肠仿生消化后仍保持相对较高的亚铁螯合率。制备花生肽亚铁时应选择低相对分子质量的花生肽作为载体，以提高花生肽亚铁的消化吸收率、稳定性和胃肠耐受性。