miR-26-5p靶向PTEN基因调控软骨细胞的增殖和凋亡

崔宏宇，陈云辉，吴治伟，郑博元

(1.广州市番禺区中心医院 创伤骨科，广东 广州 511400；2.暨南大学附属第一医院 骨关节科与运动医学中心，广东 广州 511400)

骨关节炎是一种关节的慢性、退行性疾病，其特征在于软骨损伤、软骨下骨增生、滑膜炎和其他关节组织变化。目前研究显示，软骨细胞是软骨中唯一的细胞，软骨细胞的增殖及凋亡参与骨关节炎的发生和进展[1]。微小RNA(miRNA)是长度为22 nt的非编码单链RNA分子家族，多种miRNA参与骨关节炎的发病机制[2]。最近研究发现，miR-26-5p参与骨关节炎的发病及进程[3]。PTEN能够调控细胞增殖、分化及凋亡过程，是一类抑癌因子。近期研究显示，PTEN与骨关节炎的发生密切相关[4]。据报道，miR-26-5p能够调节肿瘤细胞中PTEN的表达[5]。然而，miR-26-5p是否能调节软骨细胞中PTEN的表达，参与软骨细胞增殖和凋亡的调控尚不清楚。因此，本研究探讨miR-26-5p靶向调节PTEN的表达对软骨细胞增殖、凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料和主要试剂人膝关节软骨细胞(上海生工)；DMEM/F12培养基(美国Gibco)；噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)(美国Sigma)；miR-26-5p mimics、miR-26-5p 抑制物及阴性对照(上海吉玛)；Lipofectamine 2000脂质体转染试剂(美国Invitrogen)； SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(日本TaKaRa)；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒(北京康为世纪)；AnnexinⅤ-FITC/PI检测试剂盒(上海贝博生物)；荧光素酶报告基因重组载体构建由上海吉玛完成；电化学发光(electro chemi luminescence，ECL)试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(美国Promega)；BCA检测试剂盒和细胞裂解液(上海碧云天)；PTEN抗体、GAPDH抗体及辣根过氧化物酶标记的IgG(美国Abcam)。

1.2 细胞培养和转染人软骨细胞接种在DMEM/F12培养基(体积分数为10%的胎牛血清)中，置于体积分数为5%的CO2、37 ℃培养箱培养。待细胞生长达90%汇合时，以胰蛋白酶消化，按1∶3进行传代。传代后的软骨细胞接种到96孔板中，将软骨细胞分为3组：anti-miR-26-5p组软骨细胞转染miR-26-5p抑制物，anti-miR-NC组软骨细胞转染阴性对照，对照组软骨细胞不做转染处理，细胞转染依据Lipofectamine 2000转染试剂使用说明进行。

1.3 实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR)检测细胞中miR-26-5p表达量使用RNA提取试剂盒抽提转染48 h后3组软骨细胞总RNA，将RNA逆转录成cDNA，将cDNA作为模板，行qRT-PCR检测，反应条件设置为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共设40个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算各组软骨细胞中miR-26-5p相对表达量。

1.4 MTT法检测各组软骨细胞增殖活力将对照组、anti-miR-NC组和anti-miR-26-5p组软骨细胞接种到96孔板中，接种密度为每孔3×103个，分别在转染24、48、72 h时加入MTT试剂，4 h后再加入150 μL DMSO，至沉淀完全溶解后使用酶标仪测定波长为450 nm处吸光度值。

1.5 流式细胞术检测软骨细胞凋亡率转染48 h后的软骨细胞采用PBS洗涤3次，进行胰酶消化、离心并收集软骨细胞，加入AnnexinⅤ-FITC和PI染液，孵育15 min，采用流式细胞仪检测，采用Cell Quest软件分析软骨细胞凋亡率。

1.6 双荧光素酶报告基因实验检测miR-26-5p和PTEN的靶向关系TargetScan在线数据库预测结果显示出miR-26-5p和PTEN3’UTR存在结合位点，根据预测结果分别构建PTEN野生型(PTEN-wt)和PTEN突变型(PTEN-mut)的荧光素酶报告基因重组载体质粒。将PTEN-wt和PTEN-mut质粒分别与miR-26-5p mimics或mimics对照共转染软骨细胞，用试剂盒测定软骨细胞的相对荧光素酶活性。

1.7 Western blot检测PTEN蛋白表达分别收集转染48 h后对照组、anti-miR-NC组和anti-miR-26-5p组软骨细胞，抽提总蛋白。以BCA法测定蛋白质水平，等量蛋白样品加样后，行SDS-PAGE凝胶电泳，随后转印至硝酸纤维素膜上，封阻2 h，加入1∶1 000稀释的PTEN一抗，4 ℃过夜杂交，加入1∶3 000稀释的二抗，杂交2 h，以ECL显色，使用凝胶成像系统扫描胶片，以GAPDH标定，采用Image J软件分析条带灰度值，计算PTEN蛋白的表达水平。

2 结果

2.1 转染miR-26-5p抑制物可抑制软骨细胞中miR-26-5p的表达在软骨细胞中转染miR-26-5p抑制物及阴性对照48 h后，qRT-PCR检测结果显示，anti-miR-26-5p组软骨细胞中miR-26-5p的表达量(0.26±0.03)均较对照组(1.00±0.10)和anti-miR-NC组(0.96±0.09)低(P<0.05)。

2.2 抑制miR-26-5p对软骨细胞增殖活力的影响MTT法检测结果示，与对照组和anti-miR-NC组比较，anti-miR-26-5p组软骨细胞在转染48、72 h后增殖活力受到抑制(P<0.05)。见表1。

表1 抑制miR-26-5p对软骨细胞增殖活力的影响

2.3 抑制miR-26-5p对软骨细胞凋亡能力的影响流式细胞术检测结果显示，anti-miR-26-5p组软骨细胞凋亡率(38.46±4.28)较对照组(10.26±1.61)和anti-miR-NC组(11.03±1.55)高(P<0.05)。对照组与anti-miR-NC组细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.4 miR-26-5p靶向PTEN基因关系验证生物信息学软件预测结果显示，miR-26-5p和PTEN3’UTR存在互补结合位点。见图2A。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与PTEN-mut组相比，PTEN-wt组转染miR-26-5p mimics的软骨细胞的相对荧光素酶活性下降(P<0.05)。见图2B。Western blot检测PTEN蛋白表达水平发现，抑制miR-26-5p后软骨细胞中PTEN蛋白表达量升高(P<0.05)。见图2C。

A为生物信息学软件预测miR-26-5p与PTEN存在碱基互补结合位点；B为双荧光素酶报告基因实验检测相对荧光素酶活性，与PTEN-mut组比较，aP<0.05；C为Western blot检测转染miR-26-5p mimics对PTEN蛋白表达的影响，与对照组比较，aP<0.05，与anti-miR-NC组比较，bP<0.05。

3 讨论

骨关节炎是一种慢性关节疾病，其特征是关节软骨的退化和软骨下骨和关节边缘的骨再生。越来越多的证据表明，各种miRNA参与了骨关节炎的发生和发展。Wang等[6]揭示了骨关节炎患者和正常人的关节软骨组织中miR-140-5p/149和FUT1的差异表达谱，且发现miR-140-5p/miR-149通过靶向调控FUT1调节软骨细胞的凋亡和自噬，进而影响骨关节炎的发展。Wu等[7]研究发现miR-181可通过抑制PTEN的表达，抑制软骨细胞增殖并诱导细胞凋亡。miR-26-5p属于miR-26家族基因，其在多种肿瘤组织中异常表达，但关于其在骨关节炎中的研究目前仍较少。本实验通过下调miR-26-5p的表达观察对软骨细胞增殖和凋亡的影响，结果发现下调miR-26-5p的表达后软骨细胞增殖能力降低，凋亡率升高，表明抑制miR-26-5p可促进软骨细胞凋亡，提示miR-26-5p在骨关节炎发生过程中发挥重要作用。这与Xie等[3]的研究相符，miR-26-5p在软骨细胞中表达，miR-26-5p和NF-κB之间的相互抑制调节软骨细胞中与肥胖相关的促炎细胞因子产生，肥胖与骨关节炎的发生和发展存在因果关系，表明miR-26-5p可能在骨关节炎的发生发展中起重要作用。

最近发现，PTEN参与骨关节炎的起始，PTEN在人骨关节炎软骨和软骨细胞中表达上调，并且与软骨细胞反应和基质合成有关[8]。目前研究显示，PTEN可能是miR-26-5p靶基因，表明其功能相关性。Yu等[9]报道显示，miR-26a可通过调节PTEN的表达抑制HaCaT角质形成细胞的增殖和迁移。宁椿游等[10]研究发现，miR-26A可能通过直接抑制PTEN的表达来促进3T3-L1细胞的脂肪分化。为进一步了解miR-26-5p在骨关节炎发病和发展中的作用，本实验通过TargetScan在线预测miR-26-5p的靶基因，预测结果发现PTEN3’UTR与miR-26-5p存在靶向结合位点，后续双荧光素酶报告基因实验验证了PTEN是miR-26-5p的靶基因，随后Western blot检测结果发现了抑制miR-26-5p的表达可上调软骨细胞中PTEN的表达，进一步验证了miR-26-5p可靶向调控PTEN表达。本实验结果提示miR-26-5p靶向PTEN影响软骨细胞的增殖和凋亡，参与骨关节炎的发生。

综上，在软骨细胞中下调miR-26-5p可通过靶向PTEN基因抑制软骨细胞增殖，促进细胞凋亡。本实验只在单一细胞系中进行研究尚显不足，后续将在多种细胞系及动物模型中进行验证。随着对miR-26-5p研究的深入，相信其可能对骨关节炎发病机制及骨关节炎的治疗提供理论依据。