DOT1L，治疗骨关节炎的新靶点

逯爱梅，孙水，于辰曦

(1.山东省公共卫生临床中心临床药学部，山东 济南 250000；2.山东第一医科大学附属省立医院骨关节科，山东 济南 250021)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)，也称为退行性关节疾病，近年来随着老年人口的增多以及肥胖的流行其发病率不断提高，这给家庭、社会带来沉重的负担。然而，目前的治疗措施仅仅是减轻疼痛、缓解关节僵硬和维持关节功能，尚未有一种有效的对因治疗方法，其中一个重要原因是OA的确切发病机制尚不十分明确[1]。目前普遍认为 OA是一种多因素疾病，其中遗传学、表观遗传学因素发挥着重要作用，已成为近来OA发病机制的研究热点[2-4]。

类端粒沉默干扰体1(disruptor of telomeric silencing 1-like，DOT1L)是目前唯一的已知组蛋白H3赖氨酸79(histone H3 lysine 79，H3K79)甲基转移酶，可以S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)为甲基供体特异性地催化H3K79进行单甲基化、二甲基化和三甲基化[5]。大量研究显示DOT1L介导的H3K79甲基化参与了调节端粒沉默(telomeric silencing)、胚胎发育、DNA修复、细胞周期、基因转录等生理生化过程[5]。近来研究发现DOT1L在维持关节软骨稳态(homeostasis)、抑制OA发生发展方面发挥着重要作用[6-14]，并有可能成为OA治疗的新靶点。本文将在简介DOT1L结构特点与活性、Wnt信号通路调控关节软骨发育作用的基础上，重点阐述DOT1L在OA发生发展中的作用。

1 DOT1L的结构特点与活性

DOT1L从酵母到人类都是高度保守的，是迄今为止唯一一个被证实不含SET{Su(var)3-9,Enhancer of Zeste[E(z)],and Trithorax(trx)}催化结构域(domain)的组蛋白赖氨酸甲基转移酶(histone lysine methyltransferases)。全长度人DOT1L蛋白由1 537个氨基酸构成，分子质量为165 kDa，但仅N末端～360氨基酸序列与酵母Dot1具有明显的序列相似性[15]。其中，1～416氨基酸含组蛋白甲基转移酶催化结构域[15]。该结构域由以下3部分构成：①N末端结构域：由5个α螺旋(αA～αE)和2对短β发夹(β1、β2和β3、β4)构成；②C末端结构域：由7股β折叠(β5～β11)和5个α螺旋(αF～αJ)构成的开放α/β结构，中间为 L-EF环(loop L-EF)将两末端连接在一起。αF～αH螺旋位于β折叠前侧，而αI、αJ位于对侧。β折叠中，β5～β9和β10是同向的，但位于β9和β10之间的β11则呈反方向。紧随β11的αK螺旋，并远离结构中心。N末端与αF～αH螺旋位于β折叠同一侧。C末端(319～416氨基酸残基)是一个柔性的正电荷区域,可通过静电相互作用的方式识别并结合带负电的核小体,以实现对H3K79的催化作用；③SAM结合结构域：SAM分子作为甲基供体，位于由 L-EF环形成的SAM结合口袋(binding pocket)内。该结合口袋的入口处较宽，但在靠近蛋白质中心处变得较窄，由D1、Ⅰ、Ⅰ′、D2和Ⅱ等5个区构成，其中D1区位于L-EF环内的133～139氨基酸残基，形成结合口袋的右前部；Ⅰ区位于β5-环-αG内的161～169氨基酸残基；Ⅰ′区位于β6-环-αH内的186～189以及191氨基酸残基，Ⅰ区和Ⅰ′区共同形成结合口袋的背面；D2区位于环 L-7I内的221～224氨基酸残基，形成结合口袋入口的背面；Ⅱ区位于环 L-18内的239～245氨基酸残基，形成结合口袋的左侧。Ⅰ、Ⅰ′和Ⅱ区存在与其他SAM依赖性甲基转移酶相同的共有序列模序(consensus sequence motifs)[16]，但D1、D2区是DOT1L所特有的而其他甲基转移酶没有的序列。

Lys结合通道(lysine binding channel)位于D1区，由其内部分子间的相互作用而形成。Glu138可与N末端αD螺旋的Tyr115形成一个氢键，也可与相邻的Tyr136形成一个氢键，后者又可通过一个埋藏的水分子与Gln168发生相互作用。这些相互作用既可稳定L-EF环，又可形成通向SAM结合口袋内部的通道。该通道最狭窄处约4 Å，可容纳1个单-、双-或三-甲基化的Lys通过，其开放与关闭为Phe243-Trp305 相互作用所调节。SAM上的甲基排列在通道内，H3K79沿此通道到达其活性部位。

2 Wnt信号通路对关节软骨发育的精准调控作用

Wnt信号通路是高度保守的信号转导通路，分为Wnt/β-catenin信号通路、Wnt/Planar Cell Polarity(PCP)和Calcium(Ca2+)信号通路。其中，Wnt/β-catenin信号通路被称之为经典Wnt信号通路，具β-catenin依赖性；后两者被称之为非经典Wnt信号通路，具非β-catenin依赖性。Wnt/β-catenin信号通路的启动始于Wnt配体与受体Fz结合释放游离β-catenin，进入细胞核与LEF/TCF家族的转录因子结合，从而激活下游靶基因转录。目前Wnt配体家族共19个成员，其中Wnt2b、Wnt3、Wnt5a、Wnt5b、Wnt10a和Wnt10b在关节软骨中稳定表达，但只有Wnt16可在受损关节软骨中被快速上调(upregulation)且与β-catenin的表达相一致[17]。Chen等[18]在研究颞下颌髁突软骨发育时发现Wnt4、Wnt5a和Wnt 9a可在髁突芽基部以及后来不同的软骨层高度表达但在成人下颌髁突软骨中没有表达，提示生理情况下Wnt信号通路在软骨中的表达时空上受到精准调控。这一精准调控模式表现在关节软骨的不同发育时期Wnt信号通路发挥的作用不同，如在关节软骨发育早期决定着间充质细胞(mesenchymal cells,MCs)是分化成成骨细胞还是软骨细胞、在关节软骨发育后期促进肥大软骨细胞分化、在软骨内和膜内骨化过程中促进成骨细胞的分化和成熟等[19-22]；另一方面，Wnt信号通路的不同信号分子在关节发育的同一时期发挥的作用也不尽相同，如Wn1、Wnt4和Wnt8A抑制软骨生成(chondrogenesis)和MCs分化成软骨细胞，而Wnt5a、Wnt5b和Frzb/Frp3/Sfrp3则呈现促进作用[22]。一旦这一精准调控模式失调，关节软骨Wnt信号通路过度活化则会引发OA的发生发展[19-24]，这从另一个侧面也反映出Wnt信号通路在调控关节软骨发育与稳态的重要作用。采用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)沉默Wnt5a激活成年小鼠关节软骨内的Wnt信号通路可导致关节软骨进行性丢失、骨赘形成等OA样表型的发生[23]。相反，一些Wnt信号通路拮抗剂如lorecivivint(SM04690)的体内、体外试验均证实可抑制OA的发生发展[24]。

3 DOT1L在OA发生发展中的作用

3.1 DOT1L基因单核苷酸多态性增加髋、膝OA易感性 近来有多家研究团队开展了DOT1L基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)与髋、膝OA易感性(susceptibility)之间相关性的研究。Castano-Betancourt 等[9]针对6 523名鹿特丹人进行全基因组关联研究(genome-wide association studies，GWAS)，以关节间隙宽度(joint space width,JSW)为参数，发现染色体19p13.3 rs12982744位点G等位基因与JSW增宽5%有关，并在4 442名英国人中也得到验证，研究还显示该SNP位于DOT1L基因的第一个内含子，提示DOT1L基因SNP与髋关节OA有关[9]。Evangelou等[10]针对9 789例髋OA患者(男4 155例，女5 634例)、31 873例正常健康人(男15 213例，女16 660例)进行meta分析，发现男性患者DOT1L基因 rs12982744 C等位基因与髋OA风险增加17%有关，并具有全基因组学意义。Castano-Betancourt等[13]在2016年的研究发现位于DOT1L基因内含子区rs1180992位点与rs12982744位点非常接近并处于连锁不平衡状态，与髋OA的发生发展有关。García-Alvarado 等[11]针对墨西哥东北部麦士蒂索(Mestizo)人的研究发现DOT1L rs12982744位点与膝OA之间无显著相关性。Zhou等[12]针对605例中国汉族膝OA患者、615例年龄性别相匹配的正常健康人进行的研究，发现DOT1L基因rs12982744 GC、CC基因型和变异体C可增加中国汉族人患膝OA的风险，并且老年人(>65岁)和女性患者GC杂合子比GG纯合子患膝OA风险更大；而rs12459350 GA、AA基因型与膝OA的风险无显著相关性，且进一步按年龄或性别进行分层分析也未显示出显著相关性。尽管Castano-Betancourt 等[13]发现DOT1L基因在系统优先顺序研究(systematic prioritization study)中没有获得高分，上述DOT1L基因SNPs与髋、膝OA易感性之间相关性研究结果提示DOT1L基因SNP与髋、膝OA易感性有关，并且体内、体外实验研究结果[6-8]进一步证实DOT1L基因是OA的致病基因(causal gene)。

3.2 DOT1L参与维持关节软骨稳态 DOT1L分布于生长板(growth plate)和关节软骨，尤其是富集于肥大前软骨细胞(prehypertrophic chondrocytes)和肥大软骨细胞(hypertrophic chondrocytes)[9,14]；也分布于正常关节软骨及OA样组织中[8]。Castano-Betancourt等[9]以可模拟软骨细胞分化过程的ATDC5细胞为研究对象，敲低(knock down)DOT1L基因后采用阿尔新兰染色和蕃红O染色法显示细胞合成的硫酸蛋白聚糖(proteoglycan)较对照组细胞分别减少1.35倍和2.5倍，茜素红染色法显示矿化作用减少1.4倍，天狼星红染色法显示胶原含量减少1.8倍，提示敲除DOT1L基因(DOT1L-)可明显干扰关节软骨形成。Monteagudo 等[8]采用免疫组化法发现甲基化H3K79的信号强度在OA患者关节软骨损伤区相比非损伤区以及非OA患者的关节软骨降低，而DOT1L基因在OA患者关节软骨损伤区和非损伤区的表达却没有明显差异。体外实验发现，给予DOT1L抑制剂EPZ-5676不仅可抑制体外原代培养人关节软骨细胞H3K79甲基化，而且可诱导Ⅱ型糖原(COL2A1)分泌减少、Ⅰ型糖原分泌增加等OA样分子谱的发生[8]。体内实验也发现小鼠关节腔内注射EPZ-5676可有效抑制关节软骨细胞H3K79甲基化，并增加软骨损伤[8]。条件敲除DOT1L基因小鼠(DOT1L-cKOPrrx1)表型特征显示肢体缩短、骨形态异常和前肢脱位[6]。也有研究发现小鼠软骨细胞中DOT1L产前缺失可导致围产期死亡、骨化加速和Col10a1表达失调，出生后小鼠软骨细胞DOT1L缺失导致小梁骨丢失、细胞外基质生成减少并且生长板破裂[25]。采用内测半月板失稳诱发OA小鼠及软骨特异性DOT1L敲除(knock out)鼠(DOT1LCART-KO)为研究对象，发现DOT1L失活可导致OA的发生发展[7]。此外，DOT1L基因还可抑制破骨细胞生成[26]，可能也与其抑制OA发生发展有关。基于上述研究，可以得出结论DOT1L在维持关节软骨稳态中发挥着重要作用。

3.3 DOT1L维持关节软骨稳态的机制 人们在研究DOT1L与白血病的关系时发现DOT1L可调节Wnt信号通路活性[27]，由此推测DOT1L维持关节软骨稳态的作用也可能与Wnt信号通路有关。Castano-Betancourt等[9]以DOT1L-ATDC5细胞为研究对象，发现Wnt信号通路正向调节靶基因如Tcf1、Axin2和c-Myc表达无变化，但负向调节靶基因如骨钙蛋白(osteocalcin)表达则上调(upregulation)，这为DOT1L可调节软骨细胞Wnt信号通路提供了实验依据。进一步的实验显示，采用特异性DOT1L小分子抑制剂EPZ-5676后人或小鼠关节软骨细胞内的活性β-catenin浓度没有发生变化，表明DOT1L调节Wnt信号通路的靶点在通路下游[8]。抑制DOT1L或用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)可上调LiCl处理软骨细胞内Wnt靶基因(LEF1、TCF1和c-MYC)RNA水平，而Wnt抑制剂XAV-939可拮抗小鼠关节注射EPZ-5676所诱发的OA[8]。由此可以的结论，DOT1L维持关节软骨细胞稳态是通过负性调节Wnt 信号通路实现的。

在研究DOT1L是如何抑制Wnt信号通路时，意外发现采用沉默信息调节蛋白1(Sirtuin1，Sirt1)特异性抑制剂EX527可拮抗DOT1L抑制剂所诱导的LiCl处理细胞LEF1、TCF1上调，而Sirt1特异性激动剂SRT1720呈现相反的作用，表明Sirt1介导了DOT1L对Wnt信号通路的抑制作用[8]。抑制或者敲除DOT1L可上调软骨细胞内Sirt1活性，而当给C57/B16野生型小鼠膝关节腔内同时注射EX527与EPE-5676时发现EX527可有效降低EPZ-5676诱导OA的严重程度并可逆转Wntt信号通路的过度活化，表明DOT1L可抑制软骨细胞内Sirt1活性[8]。染色质免疫共沉淀定量PCR(chromatin immunoprecipitation-quantitative PCR，ChIp-qPCR)显示细胞经EPZ-5676处理后，转录激活因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1-α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator 1-alpha，PPARGC1A)和组蛋白乙酰转移酶KAT2A富集在LEF1和TCF1启动子上，而SIRT1抑制剂EX527可对抗EPE-5676对Wnt/β-catenin信号通路靶点的抑制作用并可降低PPARGC1A和KAT2A对LEF1和TCF1启动子的占据[8]。由此可以得出结论，DOT1L抑制Sirt1作用可能是其控制关节软骨细胞内Wnt信号通路活性以维持关节软骨健康、抑制OA发生发展的主要机制。

4 展望

目前研究显示出DOT1L是通过调控Sirt1-Wnt信号通路实现的，且突变与表型相关性分析结果在欧洲人和中国汉族人中均得到证实，显示出DOT1L作为OA治疗的靶点具有较好前景。实事求是地讲，目前研究仍在初期阶段，以下问题还要进一步明确：①OA是多因素疾病，现已开展的研究仅限于DOT1L突变对关节软骨细胞外基质的影响，今后还应扩大研究范围以明确突变对炎症、自噬、凋亡、老化等因素的影响；②DOT1L基因在人类是高度保守且分布广泛，Sutter等[6]发现条件敲除DOT1L基因可导致小鼠(DOT1L-cKOPrrx1)出现复杂的表型改变，提示仍需要大量的研究来验证其作为OA治疗靶点的特异性；③Wnt信号通路对关节软骨功能的调控非常精细，过度活化或降低均可导致OA的发生[19-22]。DOT1L维持关节软骨稳态是通过抑制Wnt信号通路活性实现的，作为靶点如何实现对Wnt信号通路的精准调控是未来要重点研究的内容之一。只有这样才能防止DOT1L作为靶点时Wnt信号通路被过度抑制诱发OA再发生或恶化，又保留DOT1L对关节软骨的有益作用。