气相色谱-串联质谱法测定沙坦类制剂中N-亚硝基二甲胺和N-亚硝基二乙胺含量

马斐，田海燕，刘向凌，肖宗阳

(德州市食品药品检验检测中心，山东 德州 253000)

世界卫生组织国际癌症研究机构致癌物清单显示，N-亚硝基二甲胺(NDMA)和N-亚硝基二乙胺(NDEA)均属于2A类致癌物质。ICH M7指南中也明确指出该类化合物具有较高致癌性[1]。近年来，随着药品监管的不断深入，在沙坦类原料药中发现含有上述两种杂质，而且部分原料药中NDMA含量超出欧盟标准200余倍，严重威胁患者的生命健康。因此，各原料药公司已经将NDMA和NDEA列入内部质量控制标准中。截至目前，国内外已建立多种原料药和制剂的NDMA和NDEA含量检测方法[2-11]，包括利用气相色谱-质谱法进行缬沙坦及厄贝沙坦原料药内NDMA和NDEA含量检测，利用超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱检测方法进行法莫替丁原料药及制剂中NDMA含量检测[11]等。成品药物中NDMA及NDEA的检验与原料药质量控制相互补充，不可或缺，但仍未见沙坦类药物制剂中NDMA及NDEA检测方法的报道。

本研究利用气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)对缬沙坦、厄贝沙坦、替米沙坦、坎地沙坦4种药物的不同剂型(片剂、胶囊、分散片)进行检测，建立了沙坦类成药制剂中NDMA及NDEA的GC-MS/MS检测方法；对30批次沙坦类制剂进行检测，发现1批阳性样品，NDMA含量低于限量值，NDEA未检出。本方法对于服务药品监管，构筑药品安全最后一道防线具有积极的促进作用。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料 气相色谱-串联质谱联用仪7890B+7010B(美国Agilent公司)；精密电子天平XSE105(瑞士Mettler-Toledo公司)；试管涡旋振荡器[德国海道尔夫(Heidolph)公司]；H1850R台式高速冷冻离心机(长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司)； 13 mm×0.22 μm PTFE滤膜(上海安谱实验室科技股份有限公司)。

NDMA对照品(2 000 μg·mL-1，纯度100%，BW901305-2000-A,批号：A1909201，北京坛墨质检科技有限公司)；NDEA对照品(100 μg·mL-1，纯度100%，BW902298-100-A,批号：A1911043，北京坛墨质检科技有限公司)；二氯甲烷(色谱纯，科密欧公司)。

1.2 对照品及供试品溶液制备

1.2.1 对照品溶液 精密量取NDMA标准溶液0.5 mL至100 mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀释至刻度，制备浓度为10 μg·mL-1的NDMA对照品溶液。分别精密量取NDMA对照品溶液(10 μg·mL-1)5 mL、NDEA对照品溶液(100 μg·mL-1)0.5 mL至同一200 mL量瓶中，加二氯甲烷溶解并稀释至刻度，制成含NDMA、NDEA均为250 ng·mL-1的对照品储备液。分别精密量取上述储备液适量，用二氯甲烷稀释，制备成质量浓度为0、2.5、5、10、30、60、125、250 ng·mL-1的系列标准工作溶液。

1.2.2 样品处理 精密称取各品种细粉适量(约相当于主成分100 mg)，置于15 mL离心管中，加入二氯甲烷5 mL，2 000 r·min-1涡旋混匀3 min，4 ℃条件下10 000 r·min-1离心10 min，上清液经0.22 μm PTFE滤膜滤过，待进样分析。

1.3 色谱条件 毛细管柱(型号Agilent VF-WAX ms，30 m×0.25 mm，0.25 μm)，升温程序：初始柱温40 ℃，保持0.5 min，20 ℃·min-1的速率升至200 ℃，保持8 min。进样口温度：250 ℃，载气为氦气，流速1 mL·min-1，不分流进样，进样量1 μL。

1.4 质谱条件 采用EI源，电压为70 eV，接口温度为280 ℃，离子源温度为230 ℃，增益因子10，溶剂延迟3.5 min，多反应监测检测模式见表1。

表1 多反应监测检测模式参数

2 结果与讨论

2.1 试验条件的考察

2.1.1 仪器选择及质谱条件优化 根据Carcinogenicity Potency Database(CPDB)数据库中致癌物质的TD50值来计算每日可接受的摄入量(ADI)，NDMA、NDEA TD50值分别为0.095 9和0.026 5 mg·(kg·d)-1[12-13]，按照人体重50 kg来计算NDMA的每天可接受摄入量为：0.095 9 mg·(kg·d)-1×50 kg/50 000 =96 ng·d-1，此时对应肿瘤发生风险为十万分之一。结合药品说明书及FDA公告中查阅到缬沙坦、厄贝沙坦、替米沙坦、坎地沙坦的每日最大用药量分别为320、300、80、32 mg[13]。限度=ADI/每日最大用药量(以缬沙坦为例，NDMA 0.3 ppm，NDEA 0.08 ppm)。根据供试品溶液中沙坦类的质量浓度为0.02 g·mL-1，可见NDMA及NDEA的定量下限须低于3 ng·mL-1、0.8 ng·mL-1(即限度浓度的50%)。国内外的检测方法现有HPLC-UV、GC-MS[1-3]、GC-MS/MS[4-7]、LC-MS/MS、LC-HRMS等，有数据表明串联质谱灵敏度比单四级杆质谱要高10倍，直接进样法比顶空灵敏度更高近1倍，为排除假阳性，满足灵敏度要求，也鉴于目前串联质谱仪的普及情况，选择GC-MS/MS直接进样法和UPLC-MS/MS两种方法进行测试。分别对质谱条件进行优化，对于目标物给予不同碰撞能量，找出信噪比高的离子对，GC-MS/MS质谱条件见表1。

2.1.2 色谱条件优化 分别考察UPLC-MS/MS和GC-MS/MS分析检测NDMA的灵敏度，发现GC-MS/MS的检出限更低，因此选用GC-MS/MS进行检测。有文献报道[14]，使用非极性色谱柱会造成亚硝胺色谱峰拖尾，使用中等、强极性色谱柱亚硝胺色谱峰尖锐对称，因此选用专为极性化合物设计的Agilent VF-WAX ms柱进行分析，能实现更高的灵敏度。

2.1.3 样品前处理 对比取样量相当于主成分500 mg和100 mg，分别进行加标回收，阳性样品测定，阳性结果均一致，加标回收率、灵敏度均满足要求，取样量较大导致辅料太多，提取液比较黏稠，杂质较多，对色谱柱及质谱污染较大，所以选择约相当于主成分100 mg的取样量进行测定。

NDMA和NDEA在甲醇和二氯甲烷中均有较好的溶解性，因此分别采用甲醇和二氯甲烷对制剂进行提取，加标量0.005 μg·kg-1，提取溶剂体积均为5 mL，比较回收率，结果表明二氯甲烷的回收率及精密度较甲醇更好，因此采用二氯甲烷作为提取溶剂。

提取时间不足也是影响目标物回收率的重要因素，超声效果较好，但是容易产热，可能造成NDMA的产生[15]，且二氯甲烷易挥发，因此选择涡旋提取，并要合理控制提取时间。设置1、3、10 min 3个提取时间，对比胶囊、分散片2种不同剂型5 ng·mL-1加标浓度下的平均回收率为78%、95%、93%，结果表明，提取时间为3 min时，可满足检验要求。

2.2 方法学验证

2.2.1 专属性 将溶剂(二氯甲烷)、对照品溶液、阴性样品溶液、阴性样品加标分别进样测定，相同保留时间处，溶剂及阴性样品均无干扰(见图1～3)。

图1 溶剂(二氯甲烷)提取离子色谱图

图2 NDMA、NDEA标准溶液提取离子色谱图

图3 加标样品提取离子色谱图

2.2.2 基质效应 选取缬沙坦分散片、厄贝沙坦分散片、替米沙坦胶囊的空白样品，分别配制低(5 ng·mL-1)、中(10 ng·mL-1)、高(30 ng·mL-1)3个水平的空白基质加标溶液和二氯甲烷溶剂标准溶液，分别进样测定，计算两种溶液中NDMA、NDEA响应值的百分比。结果表明，NDMA、NDEA在3种不同基质中的基质效应分别为90.1%～108.7%、92.6%～103.5%、95.1%～101.3%，表明基质效应不影响检测。

2.2.3 线性范围 将“1.2.1”项下配制的系列浓度对照品溶液进样测定。以所得峰面积为纵坐标Y，标准溶液的质量浓度为横坐标(X，ng·mL-1)，建立线性回归方程，并计算相关系数(r)。结果表明，NDMA在0～250 ng·mL-1范围内，线性良好，回归方程为：Y=7 733.9X+1 443.1，r=0.999 7。NDEA在0～250 ng·mL-1范围内，线性良好，回归方程为：Y=4 024.1X-1 292.5，r=0.999 7。

2.2.4 检出限和定量限 将1 ng·mL-1的NDMA和NDEA标准溶液用二氯甲烷定量逐级稀释后进行测定，以信噪比S/N≥3作为检出限，以信噪比S/N≥10作为定量限。结果表明方法的检出限NDMA为0.1 ng·mL-1，NDEA为0.08 ng·mL-1，定量限NDMA为0.3 ng·mL-1，NDEA为0.2 ng·mL-1。

2.2.5 回收率与精密度 按照“1.2.2”项下精密称取缬沙坦分散片、替米沙坦胶囊、厄贝沙坦分散片适量，至15 mL离心管中，各精密加入250 ng·mL-1的混合标准溶液适量，制备成低中高3个浓度的加标回收样品各6份，依照本方法处理，进样测定，计算平均回收率，结果见表2。NDMA平均回收率为86.9%～113.2%，RSD为2.7%～7.4%；NDEA平均回收率为91.1%～105.3%，RSD为2.8%～8.4%，表明回收率及重复性均良好。

表2 加标回收率及相对标准偏差

2.2.5 稳定性与耐用性 将5 ng·mL-1的NDMA和NDEA空白样品加标溶液，按照试验条件放置0、1、2、4、8、12 h后进样测定，记录色谱图和峰面积。结果显示NDMA和NDEA的峰面积的RSD为7.5%和8.9%，说明该条件下进行样品测定12 h内稳定性良好。

改用相似固定相的柱子Agilent DB-WAX(0.25 mm×30 m，0.25 μm)进行分析，NDMA和NDEA的检出限、分离度均能符合要求，表明方法耐用性良好。

2.3 样品测定 应用所建立的方法对30批沙坦类制剂样品进行检测，根据《国家药典委关于缬沙坦国家标准修订稿》[15]中规定NDMA不得过0.3 ppm、NDEA不得过0.08 ppm。测得阳性样品1批，其计算公式为：

[式中m0为规格80 mg，ω为平均片重或装量0.160 2 g，m为取样量0.367 3 g，V为定容体积5 mL，ω为含量(ppm)]，结果如表3所示。

表3 阳性样品测定结果

3 结论

本研究建立了沙坦类制剂中NDMA、NDEA的GC-MS/MS检测方法，其中，NDMA、NDEA的线性范围为0～250 ng·mL-1，方法的检出限NDMA为0.1 ng·mL-1、NDEA为0.08 ng·mL-1，定量限NDMA为0.3 ng·mL-1、 NDEA为0.2 ng·mL-1。NDMA平均回收率为86.9%～113.2%，RSD为2.7%～7.4%；NDEA平均回收率为91.1%～105.3%。RSD为2.8%～8.4%。应用该法对30批样品进行检测，检出阳性样品1批，NDMA含量低于限量，NDEA未检出。本方法灵敏度高、专属性好、回收率高、线性范围宽，操作简便、快速，已用于沙坦类制剂的检验，填补了该检验技术空白。