HPLC法测定消栓通络片中3种三七成分的含量

张桂英,许崇德,刘建芳，牛家丰

(1.日照市人民医院，山东 日照 276800；2.枣庄市食品药品检验检测中心，山东 枣庄 277299)

消栓通络片是一个纯中药制剂，为现行药典收载药品，由川芎、丹参、黄芪、泽泻、三七等11味中草药组成，具有活血化瘀、温经通络的作用，用于瘀血阻络所致的中风，症见神情呆滞、言语謇涩、手足发凉、肢体疼痛、缺血性中风及高脂血症见上述证候者。现行药典对该药的质量控制以薄层层析鉴别为主，主要鉴别了复方中的三七(3种皂苷)、黄芪(黄芪甲苷)、槐花(芦丁)的成分，仅利用高效液相色谱(HPLC)法对三七中含量最高的人参皂苷Rg1一种成分进行了定量检测[1-3]。三七(Panaxnotoginseng)为五加科人参属植物，具有散瘀止血，消肿止痛的功效，常用于抗炎、抗心律失常与抗血栓，活性成分为三七皂苷类化合物[1,4-5]。由于三七为消栓通络片中一味用量比较大的中草药，且为贵细药材，应该对其进行比较全面的质量控制。我们利用HPLC建立了对消栓通络片中三七的3种主要成分(人参皂苷Rb1、Rg1与三七皂苷R1)进行含量检测的方法，并对不同生产厂家的药品进行了质量检测，比较它们之间的含量差别，同时检测了药品中是否非法添加三七茎叶提取物的情况。

1 试验材料与仪器

1.1 药品与试剂 消栓通络片为从药店自购药品；人参皂苷Rb1(批号：20170601)、人参皂苷Rg1(批号：20170214)、三七皂苷R1(批号：20161121)为坛墨质检-国家标准物质中心生产；三七茎叶提取物(西安沃森生物科技有限公司，总皂苷含量80%，批号：20170218)；正丁醇(天津市富宇精细化工有限公司，批号：20181118)、甲醇(天津市富宇精细化工有限公司，批号：20190130)为分析纯；乙腈为色谱纯(TEDIA,批号:20015013)；娃哈哈纯净水(批号：20190216)。

1.2 主要仪器设备 KQ5200B 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);安捷伦1200液相色谱仪(美国Agilent公司)。色谱柱:InertSustain C18色谱柱(日本GL Sciences Lnc.)。

2 试验方法

2.1 色谱条件 柱温25 ℃；流速1.0 mL·min-1；检测波长为203 nm；流动相以乙腈为流动相A，以水溶液为流动相B，按照表1的比例变化进行梯度洗脱。

表1 流动相的梯度变化

2.2 样品溶液的制备 消栓通络片样品溶液的制备：消栓通络片去除外层包衣或薄膜衣，干燥，研磨成粉末，过60目筛，取粉末2.0 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入25 mL乙醚，超声处理20 min，经滤纸过滤，弃去滤液，残渣待挥去乙醚干燥后再以水饱和的正丁醇25 mL浸泡6 h，然后超声处理20 min，过滤，残渣再以10 mL水饱和的正丁醇洗涤，过滤，两次滤液合并，再以氨试液进行萃取两次，每次30 mL，正丁醇萃取液合并，水浴蒸干，残渣以甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，甲醇定容，溶液再以0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

药材对照品溶液的制备：称取经过60目筛的三七药材对照品与三七茎叶提取物粉末0.5 g，按照消栓通络片样品溶液的制备方法进行处理，即得。

消栓通络片三七阴性对照溶液的制备：按照药材组方的比例，取缺少三七的另外10种药材，按照消栓通络片的制备方法进行制备，称取2.0 g，按照消栓通络片样品溶液的制备方法进行处理，即得。

3种对照品溶液的制备：分别称取人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1对照品5 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入适量甲醇，超声溶解，再以甲醇溶液定容，摇匀，备用。

2.3 系统适用性试验 取对照品溶液、供试品(样品4，批号：170302)、三七阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取含有三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb13种对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，以甲醇稀释至10 mL，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.5 精密度试验 按“2.1”项下色谱条件，分别精密吸取浓度为0.102 mg·mL-1的三七皂苷R1、0.104 mg·mL-1的人参皂苷Rg1、0.102 mg·mL-1的人参皂苷Rb1对照品溶液各10 μL，连续重复进样5 次，记录3个对照品的峰面积。

2.6 重复性试验 取消栓通络片粉末(样品4，批号：170302)约2 g，精密称重，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按色谱条件检测，精密吸取供试品溶液10 μL，注入色谱仪，共进样5次，记录3个对照品的峰面积。

2.7 稳定性试验 取消栓通络片粉末(样品4，批号：170302)约2 g，精密称重，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按色谱条件，精密吸取供试品溶液 10 μL，分别在0、4、8、12、16、24 h 进样，记录3个对照品的峰面积。

2.8 回收率试验 取6份已知含量的消栓通络片粉末(样品4，批号：170302)约2 g，精密称重，分别加入编号1～6 的25 mL容量瓶中，精密吸取三七皂苷R10.101 mg、人参皂苷Rg10.102 mg、人参皂苷Rb1对照品0.101 mg，按供试样品溶液制备方法，依色谱条件测定，记录色谱图及峰面积，计算回收率。

3 试验结果

3.1 系统适用性试验 按“2.1”项下色谱条件测定，典型的色谱图见图1～4。

1.三七皂苷R1；2.人参皂苷Rg1；3.人参皂苷Rb1图1 3种三七皂苷对照品的色谱图

图2 消栓通络片样品的色谱图

图3 三七茎叶提取物的色谱图

图4 消栓通络片三七阴性对照溶液的色谱图

3.2 线性关系考察 根据试验色谱图(见图1)，以峰面积值为纵坐标(Y)，进样浓度为横坐标(X)绘制标准曲线，计算回归方程。三七皂苷R1Y=6 000.68X+210.61，r=0.999 6；人参皂苷Rg1Y=7 818.54X+ 191.23，r=0.999 7；人参皂苷Rb1Y= 5 348.27X+207.05，r=0.999 7。结果表明，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1分别在0.025～0.51、0.026～0.52、0.025～0.51 mg·mL-1的范围内与峰面积呈良好线性关系。

3.3 精密度试验 根据试验色谱图，记录3个对照品的峰面积，RSD分别为2.28%、1.39%、1.83%(n=5)，说明仪器的精密度良好。

3.4 重复性试验 根据试验色谱图，记录3个对照品的峰面积，RSD分别为1.84%、2.03%、1.91%(n=5)。结果表明，本方法重复性良好。

3.5 稳定性试验 根据试验色谱图，记录3个对照品的峰面积，RSD分别为1.73%、2.15%、1.83%(n=6)。结果表明，供试品溶液在24 h 内基本稳定。

3.6 回收率试验 依色谱条件测定，记录色谱图及峰面积，计算回收率。结果平均回收率分别为100.51%、99.68%、98.12%，RSD分别为2.16%、2.01%、2.87%(n=6)。

3.7 样品含量测定结果 按照前文建立的测定方法，对本次自购的6个生产厂家共计12个生产批次的消栓通络片中三七皂苷的含量进行了测定，结果见表2。

表2 消栓通络片中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的含量

4 讨论

在进行HPLC分离时，本论文参阅了药典对三七药材和含有三七的中成药对三七皂苷的HPLC检测条件[1,6-8]，发现它们的出峰时间比较长，我们对色谱条件进行了改变，缩短了出峰时间，指标成分的色谱峰之间无干扰、专属性、分离度及稳定性也比较好，符合质量检测的要求。

对6个生产厂家共计12个生产批次的消栓通络片中三七皂苷的检测结果进行分析，发现被检测的消栓通络片中3种三七皂苷类成分都有明显的HPLC色谱峰出现，且没有明显的三七茎叶提取物的HPLC色谱峰，说明被抽检的药品没有以三七茎叶提取物代替三七根入药的非法添加情况(三七茎叶提取物在25 min后出现比较明显的色谱峰，但消栓通络片样品中这些色谱峰不明显，见图2～3)[9-10]。对不同企业、不同生产批次产品的结果进行比较，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量大都稳定在1.11～1.54 mg·g-1(平均值为1.35 mg·g-1)、5.85～8.31 mg·g-1(平均值为7.08 mg·g-1)、2.92～4.41 mg·g-1(平均值为3.46 mg·g-1)，不同企业药品之间三七总皂苷的含量整体比较稳定，含量差别不是非常明显。