瑶药多穗柯提取物对糖尿病大鼠基质金属蛋白酶8、9的影响作用研究

邓聿胤，王丽，吕纪华，刘瑛，覃良，叶银斯，洪芷琴

(1.广西壮族自治区中医药研究院/广西中药质量标准研究重点实验室，广西壮族自治区 南宁 530022；2.柳州市红十字会医院，广西壮族自治区 柳州 545000；3.桂林医学院，广西壮族自治区 桂林 541004)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由遗传、环境等因素联合引起的以糖代谢紊乱为重要表现的一种代谢综合征，其主要表现为多饮、多食、多尿、体重减少及疲乏无力等，严重者甚至出现糖尿病酮症酸中毒，影响患者生命健康。据统计，目前全球约有3.47亿糖尿病患者，到2030年可能增加到4.39亿，我国2型糖尿病患病率上升至11.2%[1-3]，持续增长趋势使糖尿病成为全球重大公共卫生问题之一，寻找安全有效的降糖药物是目前亟待解决的关键问题。多穗柯为壳斗科植物木姜叶柯[Lithocarpuslitseifolius(Hance)Chun.]的干燥叶[4]，主要分布于广西百色、凌云、河池等地，是广西传统壮瑶药。民间用于治疗糖尿病、肺热咳嗽、咽炎、心脑血管等疾病，具有清热利尿、滋润肝肾之功效。本文以降血糖功效为切入点，观察多穗柯水提物对糖尿病大鼠胰岛素(INS)、糖化血红蛋白(GHbA1c)、基质金属蛋白酶-8(MMP-8)及基质金属蛋白酶-9(MMP-8)的影响作用，为多穗柯降糖药物的研制提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康成年SD大鼠，雌雄各半，SPF级，体重(200±20)g ，均购自广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK桂2014-0002。实验动物适应性饲养1周后用于实验，饲养环境：温度20～25 ℃，相对湿度60%±10%，自由饮食，实验动物使用许可证号：SYXK桂2016-0006。

1.2 药物 多穗柯叶，采自广西巴马市，经广西壮族自治区中医药研究院制剂中心饶伟源主任药师鉴定为壳斗科植物木姜叶柯[Lithocarpuslitseifolius(Hance)Chun.]后使用。四氧嘧啶(Sigma公司，批号：BCBR9198V)；链脲佐菌素(STZ，Sigma公司，批号：WXBC8740V)；盐酸二甲双胍片(北京京丰制药集团，批号：180617)。

1.3 主要试剂 枸橼酸盐缓冲液(博士德生物工程有限公司，批号：12D10B24)；大鼠胰岛素(INS)、糖化血红蛋白(GHbA1c)、基质金属蛋白酶-8(MMP-8)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)ELISA检测试剂盒均购自天津安诺瑞康生物技术有限公司，批号分别为358190226、603190226、420180424、425180424；美迪信血糖试纸(天津亿朋医疗器械股份有限公司，批号：SSL20Z2D1)。

1.4 主要仪器 TDL-5-A低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)；Multiskan Go全波长全自动多功能酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司)；BS224S型电子天平(北京赛多利斯)；美迪信血糖仪(天津亿朋医疗器械股份有限公司)。

1.5 实验方法

1.5.1 糖尿病大鼠模型制备[5]选取健康成年SD大鼠80只，雌雄各半，体重(200±20)g，适应性饲养1周后，随机分为正常组10只和模型组70只，正常组给予基础饲料喂养，模型组给予高脂饲料(基础饲料60.4%+猪油10%+蛋黄粉8%+胆固醇1.5%+蔗糖20%+胆酸钠0.1%)喂养，共4周。4周后所有大鼠禁食不禁水 12 h，模型组给予腹腔注射STZ 40 mg·kg-1(枸橼酸钠缓冲液配制)，正常组给予等体积枸橼酸钠缓冲液。72 h后剪尾采血测随机血糖，如果造模前血糖<8.9 mmol·L-1，造模后血糖≥16.7 mmol·L-1，体重明显下降者即为造模成功。成模大鼠以正常饲料继续喂养1周，测定血糖稳定后用于后续实验。

1.5.2 多穗柯提取物制备 取多穗柯叶5 kg，切碎加10倍水煎煮2次，第一次1.5 h，第二次1 h，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.25(60 ℃)的清膏，得到多穗柯水提物，每克清膏含2.7 g生药。灌胃时按照相应剂量配制成相应药液使用。

1.5.3 分组给药 选取糖尿病造模成功血糖稳定大鼠50只，随机分为模型组、二甲双胍组(Met)、多穗柯水提物(DSK)高、中、低剂量组，每组10只。各组大鼠于分组次日开始灌胃给药，DSK高、中、低剂量组给药剂量分别为7、3.5、1.75 g生药/kg，Met组给药剂量为0.233 g·kg-1，给药体积10 mL·kg-1，正常组及模型组给予等体积蒸馏水，每天1次，连续4周。

1.5.4 指标检测 末次给药后禁食不禁水12 h，各组大鼠测定体重，水合氯醛腹腔注射麻醉，剪尾采血测定空腹血糖，腹主动脉采血，离心取血清(3 000 r·min-1离心10 min，离心半径15 cm)后，应用ELISA法检测血清INS、GHbA1c、MMP-8及MMP-9水平。大鼠取血后处死，取胰腺组织，10%甲醛固定，脱水，常规石蜡包埋，切片，HE染色，进行组织学评价。

2 结果

2.1 多穗柯对糖尿病大鼠体重和空腹血糖的影响 与正常组比较，模型组大鼠体重显著降低，空腹血糖显著升高(P<0.05)；与模型组比较，多穗柯中剂量组和二甲双胍组给药4周后大鼠体重明显增加，多穗柯高、中剂量组及二甲双胍组给药4周后大鼠空腹血糖明显降低(P<0.05)，提示多穗柯水提物可以显著增加糖尿病大鼠的体重，降低糖尿病大鼠的空腹血糖(见图1～2)。

图1 各组大鼠体重水平比较 注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05

2.2 多穗柯对糖尿病大鼠血清INS、GHbA1c的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清INS水平显著降低，血清GHbA1c水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，多穗柯高、中剂量组和二甲双胍组大鼠血清INS水平显著升高，血清GHbA1c水平显著降低(P<0.05)，提示多穗柯水提物可以提高糖尿病大鼠胰岛素分泌，调控糖化血红蛋白水平(见图3～4)。

图2 各组大鼠空腹血糖水平比较 注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05

图3 各组大鼠血清INS水平比较 注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05

2.3 多穗柯对糖尿病大鼠血清MMP-8、MMP-9的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清MMP-8、MMP-9水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，多穗柯高、中、低剂量组和二甲双胍组大鼠血清MMP-9水平均显著降低，二甲双胍组大鼠血清MMP-8水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，多穗柯各剂量组大鼠血清MMP-8水平有下降趋势，但无统计学差异(P>0.05)。提示多穗柯水提物可以调节糖尿病大鼠血清MMP-9水平(见图5～6)。

图4 各组大鼠血清GHbA1c水平比较 注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05

图5 各组大鼠血清MMP-8水平比较 注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05

图6 各组大鼠血清MMP-9水平比较 注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05

2.4 多穗柯对糖尿病大鼠胰腺组织的影响 镜下显示：正常组大鼠胰腺组织结构正常，胰岛为圆形或椭圆形，细胞轮廓规则整齐；模型组大鼠胰腺组织结构紊乱，胰岛细胞萎缩，轮廓不规则，排列紊乱，有脂肪病变；与模型组比较，多穗柯高、中、低剂量组和二甲双胍组大鼠胰腺组织病理病变明显减轻(见图7)。

A.正常组;B.模型组;C.Met(0.233 g·kg-1);D.DSK(7 g·kg-1);E.DSK(3.5 g·kg-1);F.DSK(3.5 g·kg-1)图7 各组大鼠胰腺组织病理(HE×200)

3 讨论

糖尿病是以慢性高血糖为主的内分泌代谢疾病，其病理机制以胰岛素抵抗为主，伴胰岛素分泌明显缺陷或胰岛素相对不足从而产生胰岛素抵抗障碍[6]。糖尿病的治疗目前主要集中在两个方向：一是通过肌注胰岛素合成制剂来降低血糖；二是通过口服降糖药物来降低血糖。临床应用广泛的口服降糖药主要是双胍类和磺脲类，需结合年龄、病程、肝肾功能状况等多方面因素指导使用，使用不当或长期服用均会产生低血糖、胃肠道反应等副作用[7-9]。因此，寻找疗效确切、副作用小、安全稳定的口服降糖药仍是糖尿病药物研究的主要方向。

胰岛素是由胰岛β细胞产生的内分泌激素，能够调节机体血糖、加速葡萄糖的摄取和利用，是反映胰岛素细胞贮备和分泌功能的重要指标。在长期高脂状态下，胰岛分泌胰岛素代偿性增加，使胰岛功能逐渐衰竭，从而导致胰岛素分泌降低，葡萄糖摄取和利用减少从而使机体血糖升高。糖化血红蛋白在机体中通过持续、缓慢且不可逆的糖化反应形成，是红细胞中血红蛋白与血清中糖类相结合的产物，血糖浓度及血糖与血红蛋白接触的时间均能够影响糖化血红蛋白的含量，《中国2型糖尿病防治指南(2020年版)》将“糖化血红蛋白”首次正式纳入糖尿病诊断标准中[10-11]。因此，胰岛素与糖化血红蛋白均可作为评价降糖药物作用的重要指标。本研究中多穗柯能够显著提高糖尿病大鼠胰岛素分泌水平，降低血清糖化血红蛋白含量，改善胰腺组织病变，提示多穗柯能够提高机体对糖尿病的耐受性，改善胰岛功能，促进胰岛素分泌，调控糖化血红蛋白水平，具有降糖效应。

糖尿病病因还与众多细胞因子和酶活性改变有关，基质金属蛋白酶(MMPs)是一类具有类似结构和共同生物化学性质的金属依赖性蛋白内切酶家族。在2型糖尿病中，高血糖引起的糖基化终末产物积累，及高胰岛素血症导致的ROS和氧化应激增加[19]，均会显著促进MMPs 的高表达和酶活性增强。MMP-9主要是由中性粒细胞分泌产生的酶，MMP-8是一种多形核细胞的间质胶原酶，研究显示[12-13]，2型糖尿病患者血清中MMP-9、MMP-8水平均显著升高，在一定程度上反映了糖尿病早期血管病变，对评估、发现早期糖尿病及糖尿病并发症意义重大。本研究中糖尿病模型大鼠血清MMP-8、MMP-9水平显著升高，与文献报道相符。多穗柯能够显著降低糖尿病大鼠血清MMP-9水平，提示多穗柯也许能够通过调控MMP-9水平干预糖尿病大鼠早期血管病变。

综上所述，本研究对瑶药多穗柯降糖作用进行了实验研究，明确了瑶药多穗柯具有降糖作用，其机制可能与改善胰岛功能，促进胰岛素分泌，调控糖化血红蛋白与MMP-9水平，提高机体对糖尿病的耐受性有关，为多穗柯的开发应用提供了理论依据。但本文仅开展了多穗柯降糖药效作用研究，其化学成分及作用机制有待进一步深入探讨。