栀子苷的提取及酶促水解生产京尼平的研究
2021-10-18李曦杰邓月峰王举政李大力
李曦杰,邓月峰,王举政,阳 杰,黄 晗,李大力
(南京理工大学 生物工程系,江苏 南京 210094)
栀子是茜草科植物栀子的干燥成熟果实。最早记录于《神农本草经》,经过现代研究分析,栀子中含有种类繁多的化学成分,栀子苷是栀子果实中的主要生物活性成分之一,属于环烯醚萜类化合物,在杜仲和管花肉苁蓉等植物也有发现[1-3]。栀子苷有抗炎、利胆、止痛、解热、轻泻和镇静等作用[4-6],是栀子抗炎和治疗扭挫伤的主要成分,同时其还在植物分类学方面及吲哚生物碱的合成中具有重要意义。栀子苷的提取一般分为两步,首先需要将栀子果实中的有效成分进行粗提,再将粗提液进行分离纯化以得到纯度较高的栀子苷。粗提有效成分的技术一般为煎煮法、超声提取法、回流法和浸提法等。从栀子果实中粗提出来栀子苷大都含有许多杂质,栀子苷的提纯方法有活性炭除杂法、硅胶吸附法、铅盐沉淀法等。2008年,Liu通过运用柱层析的方法,在最优条件下将提取液栀子苷的含量从50%提纯至95%[7]。2005年,姚干等采用HPD 450大孔吸附树脂纯化粗提液也得到纯度62%以上的栀子苷样品[8]。栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解可得到京尼平。京尼平是一种环烯醚萜类化合物,具有保肝利胆、抗癌、镇痛、降血糖等作用,京尼平还可作为一种新型的天然交联剂,能够与蛋白质、明胶和壳聚糖等发生交联反应从而制备生物材料,如栀子蓝、栀子红、凝胶膜等[9-11]。本研究用乙醇浸提栀子果实中的栀子苷,用AB-8大孔吸附树脂层析纯化栀子苷,用固定化β-葡萄糖苷酶对纯化后的栀子苷进行酶促水解,获得了富含京尼平的栀子苷水解液。
1 实验材料和过程
1.1 材料与试剂
京尼平购自Aladdin公司。AB-8大孔树脂购自安徽三星树脂科技有限公司。栀子苷及其他试验所用试剂均购自国药集团。高效液相色谱仪为日本岛津公司产品。
1.2 乙醇浸提
用分析天平称取50 g栀子果实置于家用食品破碎机中,快速破碎5 min。将栀子粉加入400 mL50%乙醇中室温浸泡48 h,使用尼龙滤布(400目)过滤,滤液收集用于后续纯化。以200 mg·L-1比例加入明矾沉降杂质,5 h后用滤纸过滤,收集滤液。
1.3 大孔吸附树脂纯化栀子苷粗提液
将AB-8大孔吸附树脂加入层析柱,用无水乙醇对层析柱进行淋洗,直至流出的无水乙醇滴入清水中无白色浑浊;用3个柱体积的去离子水洗涤层析柱;将用去离子水稀释2倍的栀子苷浸取液以1 mL·min-1的流速进样,上样完成后使用2个柱体积的去离子水洗涤层析柱;先使用30%乙醇溶液进行洗脱,收集保存洗脱液,然后用50%乙醇溶液再次洗脱层析柱,保存洗脱液。
1.4 酶促水解栀子苷粗提液
参照Ouyang[12]等人的报道制备以壳聚糖为载体的β-葡萄糖苷酶(壳聚糖@β-葡萄糖苷酶)。将0.1 g壳聚糖@β-葡萄糖苷酶加至5 mL含有磷酸盐缓冲液(pH 6.0,50 mM)中,随后加入5 mL 50%乙醇洗脱物,50℃反应12 h后,离心分离壳聚糖@β-葡萄糖苷酶。上清液为栀子苷水解液。
1.5 TLC与HPLC分析
用薄层层析(TLC)定性检测栀子苷和京尼平,展层剂为氯仿:甲醇= 4:1(v/v)。用高效液相色谱(HPLC)对栀子苷含以及京尼平含量进行定量分析,检测波长为260 nm,流动相为甲醇:水= 40:60(v/v),流速为0.4 mL·min-1。
2 实验结果与分析
2.1 栀子苷的提取结果
栀子苷分离纯化各步骤样品的HPLC分析结果如图1。从HPLC分析结果中可以看到,乙醇对栀子果实进行浸提,浸取液中杂质较多。30%乙醇洗脱层析柱,洗脱物中含大部分杂质,同时也含有少量栀子苷,而50%乙醇再次洗脱后,洗脱物中栀子苷的纯度较高,杂质较少。计算得到50%乙醇洗脱物中栀子苷浓度为1.495%,栀子中栀子苷的提取收率为1.79%。经层析纯化处理后的栀子苷液(右)与标准样(左)的TLC结果如图2,左侧为栀子苷标准样;右侧为树脂纯化后的栀子苷,可观察到AB-8大孔吸附树脂层析对栀子苷纯化效果较好。
图1 栀子苷分离纯化各步骤样品的HPLC分析图
图2 栀子苷的TLC分析结果
2.2 酶水解栀子苷的结果
HPLC和TLC检测壳聚糖@β-葡萄糖苷酶对栀子苷的水解反应液中栀子苷与京尼平的含量变化如图3-4,图4中左侧为京尼平标准样;中间为水解1h反应液;右侧为水解12 h反应液。反应刚开始时溶液中无京尼平,反应进行1 h后,反应溶液中的栀子苷含量下降,京尼平生成。反应12 h后,反应液上清为含有大量京尼平的栀子苷水解液。
图3 壳聚糖@β-葡萄糖苷酶水解纯化栀子苷反应溶液HPLC分析
图4 栀子苷酶促水解液的TLC分析结果
3 结 论
采用乙醇对栀子果实中的栀子苷进行浸提后,利用AB-8大孔吸附树脂对栀子苷进行纯化,获得的栀子苷经壳聚糖@β-葡萄糖苷酶水解12 h后即可获得富含京尼平的水解液。可离心去除壳聚糖@β-葡萄糖苷酶以避免蛋白对制备液的污染。这种制备京尼平的方法简单有效且对环境友好。