层析介质Capto Core400 和Sephacryl S-1000纯化乙型肝炎病毒核心蛋白病毒样颗粒效果的比较

郎艺洁，王云龙，李玉林，王继创，王旭东，王晓军，周丽，钱鹏

1.郑州大学生命科学学院，河南 郑州 450001；2.河南省生物工程技术研究中心，河南 郑州 450010；3.郑州职业技术学院，河南 郑州 451460；4.河南省职工医院，河南 郑州 450002

病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）是由一种或多种病毒结构蛋白组装成的颗粒，其形态与真病毒粒子相似，但不含病毒基因组结构，又称“伪病毒或假病毒”［1］。基于乙型肝炎病毒核心蛋白（hepatitis B virus core protein，HBc）基因序列的C-末端、N-末端及主要免疫原区（main immunogenic region，MIR）在插入外源基因后，仍可进行正确折叠和组装，因此，HBc VLPs 成为目前众多领域中研究最为广泛的纳米载体［2］。

层析介质Capto Core400 是基于核心微球的一种纯化介质，每个微球均含有1 个由辛胺配体激活的核心［3］，该核心被一层无配体的外层包围，可阻止大颗粒物质与配体结合，较小的杂质可自由进入，被微球捕获。蛋白质的截留相对分子质量约为4 × 105，大于该值的目标蛋白将随着洗脱液流出层析柱。层析介质Sephacryl S-1000 是葡聚糖交联N，N-亚甲基二乙酰胺形成的一种纯化介质，所能分离蛋白质的截留相对分子质量为5×105～1×108，具有良好的机械性能。两种介质在生物制品纯化中均有较广阔的应用价值［4］。本研究采用两种层析介质纯化HBc VLPs蛋白粗提液，并对纯化效果进行比较，以期为HBc VLPs的纯化选择一种简便可靠的纯化工艺。

1 材料与方法

1.1载体及菌株 载体pET-43.1a（+）及感受态E.coliBL21（DE3）均由河南省生物工程技术研究中心提供。

1.2主要试剂及仪器 核酸内切酶NdeⅠ、XhoⅠ均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；IPTG 及BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海索莱宝生物科技有限公司；氨苄西林购自北京梦怡美生物科技有限公司；Tris、NaCl 及NaOH 购自国药集团化学试剂有限公司；层析介质Sephacryl S-1000、Capto Core400 及空层析柱Column XK50 ／ 100、Column XK26 ／ 30 均购自美国GE Healthcare 公司；Ultrahydrogel 2000 购自美国Waters 公司；马尔文粒径仪购自英国马尔文仪器有限公司。

1.3HBc VLPs 蛋白的诱导表达 根据NCBI 中登录的HBc基因序列（944568），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成该基因序列。HBc基因序列经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后，插入至经同样酶酶切的载体pET-43.1a（+）中，构建重组质粒。转化感受态E.coilBL21（DE3），于26 ℃培养过夜；挑取单菌落，加入含100 μg ／ mL 氨苄西林的LB 液体培养基中，37 ℃，210 r／min 摇床振荡培养10 h；加入IPTG 至终浓度50 μg ／ mL，25 ℃诱导表达12 h；2 000 ×g离心4 min，取沉淀，超声破碎，用20%及40%硫酸铵沉淀，获得HBc VLPs 蛋白粗提液。

1.4HBc VLPs 蛋白的纯化

1.4.1Sephacryl S-1000 层析 将Sephacryl S-1000层析介质装入空层析柱Column XK50 ／ 100 中，用缓冲液1（含300 mmol ／ L NaCl 的20 mmol ／ L Tris）常温平衡层析柱2 个柱体积，上样HBc VLPs 蛋白粗提液，蠕动泵上样流速为：4 r ／ min，上样量为：600 mg。用缓冲液1 洗脱层析柱，280 nm 处吸光度值升至20 ～30 mAU 时开始收集第1 峰，吸光度值达峰顶值后下降至70 ～80 mAU 时停止收集；用缓冲液1 洗脱层析柱，当吸光度值上升至90 mAU 时开始收集第2 峰，下降至70 ～80 mAU 时停止收集；缓冲液1 冲洗半个柱体积，再用0.5 mol ／ L NaOH 洗涤，缓冲液1 平衡至流出液pH 为8。每管收集50 mL，共收集14 管，共上样3 个批次的HBc VLPs。

1.4.2Capto Core400 层析 将Capto Core400 层析介质装入空层析柱Column XK26 ／ 30 中，用缓冲液1常温平衡层析柱2 个柱体积，上样HBc VLPs 蛋白粗提液，蠕动泵上样流速为：4 r／min，上样量为：600 mg。上样后用缓冲液1 洗脱层析柱，280 nm 处吸光度值升至20 ～30 mAU 时开始收集，吸光度值达峰顶值后下降至70 ～80 mAU 时停止收集；缓冲液1 冲洗半个柱体积，再用0.5 mol ／ L NaOH 洗涤，缓冲液1 平衡至流出液pH 为8。每管收集50 mL，共收集8 管，上样批次同1.4.1 项。

1.5HBc VLPs 浓度检测 BCA 法测定蛋白浓度，并按下式计算回收率。

1.6HBc VLPs 纯度检测 采用体积排阻色谱法。色谱柱为：Ultrahydrogel 2 000；紫外PDA 检测器，检测波长为：280 nm；流动相为：20 mmol／L PBS，150 mmol／L NaC；上样量为：20 μL；流速为：0.6 mL ／ min；检测时间为：30 min；柱温为：25 ℃。

1.7HBc VLPs 粒径检测 将两种层析介质纯化的HBc VLPs 稀释至相同浓度，通过马尔文粒径仪对HBc VLPs 进行粒径检测。

1.8HBc VLPs 形态观察 取适量相同浓度的两种层析柱纯化后的HBc VLPs 滴至铜网上，静置2 min，用滤纸从铜网的一边吸取液体，滴加1%磷钨酸，静置2 min；用滤纸从铜网的一边吸取液体，放入玻璃平皿中，待铜网上的液体自然晾干；将制备好的铜网固定在样品握持杆的样品台上，插入至样品室内，抽真空后，置透射电子显微镜观察，并拍照。

2 结 果

2.1两种层析介质纯化HBc VLPs 的洗脱曲线 Sephacryl S-1000 的洗脱曲线可见2 个流穿峰，第2 峰为主要目的蛋白；Capto Core400 的洗脱曲线可见1 个流穿峰，为目的蛋白。取其中1 批HBc VLPs 的纯化结果绘制洗脱曲线，见图1 和图2。将Sephacryl S-1000 层析柱纯化后的第5 ～12 管HBc VLPs 进行合并作为目的蛋白，Capto Core400 层析柱纯化后的第1 ～8 管全部合并作为目的蛋白，用于后续检测。

图1 层析介质Sephacryl S-1000（A）及Capto Core400（B）纯化HBc VLPs 的洗脱曲线Fig.1 Elution curves of HBc VLPs purified with Sephacryl S-1000（A）and Capto Core400（B）

2.2两种层析介质纯化HBcVLPs 的蛋白回收率 层析介质SephacrylS-1000 和CaptoCore400 纯化HBcVLPs的蛋白回收率分别为75.5%和70.5%。

2.3两种层析介质纯化HBc VLPs 的纯度 层析介质Sephacryl S-1000 和Capto Core400 纯化HBc VLPs的蛋白纯度分别为87%和99%，见图2。

图2 体积排阻色谱法检测层析介质Sephacryl S-1000（A）及Capto Core400（B）纯化HBc VLPs 的纯度Fig.2 Determination of purity of HBc VLPs purified with Sephacryl S-1000（A）and Capto Core400（B）by size-exclusion chromatography

2.4两种层析介质纯化HBc VLPs 的粒径 经两种层析介质纯化后，HBc VLPs 均出现单一粒径峰，粒径大小均为（30 ± 4）nm，均一性良好，颗粒分布均匀，见图3。

图3 层析介质Sephacryl S-1000（A）及Capto Core400（B）纯化HBc VLPs 的粒径图Fig.3 Sizes of HBc VLPs purified with Sephacryl S-1000（A）and Capto Core400（B）

2.5两种层析介质纯化HBc VLPs 的形态 透射镜下观察可见，与Sephacryl S-1000 比较，经Capto Core400纯化的HBc VLPs 分布更均匀，见图4。

图4 层析介质Sephacryl S-1000（A）及Capto Core400（B）纯化HBc VLPs 形态的镜下观察（× 200 000）Fig.4 Electron microscopy of morphologies of HBc VLPs purified with Sephacryl S-1000（A）and Capto Core400（B）（×200 000）

3 讨 论

目前，国内厂家生产HBc VLPs 采用多种方法结合的形式进行纯化，如盐析、分子筛层析及离子交换层析联用［5］，凝胶过滤层析、离子交换与蔗糖密度梯度离心联用［6-7］；另外，还可通过改变温度的热处理法进行纯化［8］。多种纯化方法联用的过程较复杂［9］，且可重复性较低，不适用于大规模生产。

Capto Core 系列层析介质具有双层结构，表层是带有小孔的惰性层，可截留大分子，使之直接流穿，小分子通过小孔进入填料内部核心区域。核心区域-Core 带有复合模式的辛氨基团，可吸附结合杂质分子，因此，Capto Core 填料具有分子筛与吸附层析（电荷+ 疏水性）的双重特点，可用于纯化多种物质。Capto Core700 可以流动模式提纯较大的生物分子和生物制品［10］，如用于登革热嵌合减毒活疫苗的大量纯化［11］，还可用于多种病毒的纯化［12-15］，其中对轮状病毒的纯化可有效去除宿主蛋白，病毒收率达80%以上［16-17］。目前，用Capto Core400 层析介质进行HBc VLPs 纯化的研究鲜见报道。本研究用Sephacryl S-1000 和Capto Core400 两种层析介质纯化3 批HBc VLPs 粗提液，并对纯化效果进行对比，结果表明，层析介质Sephacryl S-1000 和Capto Core400 纯化HBc VLPs 的蛋白回收率分别为75.5%和70.5%，蛋白纯度分别为87%和99%，粒径大小均为（30 ± 4）nm，均一性良好；与Sephacryl S-1000 比较，经Capto Core400 纯化的HBc VLPs 分布更均匀。另外，Capto Core400 层析柱的柱床体积（133 mL）远小于Sephacryl S-1000 层析柱（1 570 mL），且Capto Core400 层析柱的线性流速（45 cm／h）也高于Sephacryl S-1000 层析柱（12 cm ／ h），节约了层析介质及缓冲液用量，缩短了纯化时间。因此，层析介质Capto Core-4 00 更适用于HBc VLPs 的规模化生产，有望成为HBc VLPs 及其衍生物纯化的新工艺。