液相色谱-串联质谱法同时快速测定婴幼儿谷物食品中3种莨菪烷生物碱

胡 侠，付丽莎

(大连产品质量检验检测研究院有限公司，辽宁 大连 116023)

阿托品、东莨菪碱和山莨菪碱均属于莨菪烷类生物碱，含此类生物碱的植物分布广泛，误食它们能引起摄食者轻微的肝损伤，严重时可能对神经系统、消化系统造成损害，甚至出现内分泌失调等症状[1]。随着农业机械化程度的发展，人们在收获米粉、高粱、荞麦等谷物时，含有莨菪烷类生物碱的植物混入原料中的风险增大，以这些原料加工成婴幼儿谷物的加工食品，含有莨菪烷类生物碱的可能性加大。欧盟等国和地区允许莨菪烷类生物碱婴幼儿谷物食品中的阿托品、东莨菪碱残留限量为1.0 μg·kg-1。为保障婴幼儿谷物食品产品质量安全，建立婴幼儿谷物食品中莨菪烷类生物碱残留的检测方法是非常必要的。

目前，国内外莨菪烷类生物碱含量的测定方法有液相色谱法(HPLC)[2-5]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[6]、液相色谱-串联质谱法[7-12](LC-MS/MS)和毛细管电泳法[13-14]等，主要集中在体液、药物和药用植物中莨菪烷类生物碱的测定，婴幼儿谷物食品中3种莨菪烷类生物碱的测定方法还未见报道。因此，本研究以液相色谱串联质谱法( LC-MS/MS) 为检测手段，建立了婴幼儿谷物食品中3种莨菪烷类生物碱的检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 6460 Triple Quad LC/MS(Agilent公司)；CR21GIII高速离心机(日本Hitachi公司)；超声波清洗仪(昆山禾创仪器有限公司)；N-EVAP-24氮吹仪(美国Organomation Associates公司)；固相萃取装置(Supelco公司)；Sartorius arium61315 超纯水发生器(德国Sartorius公司)；甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯；实验用水为高纯水，消旋山莨菪碱标准品 (上海源叶生物科技有限公司)，东莨菪碱标准品(J&K公司 )，阿托品标准品 (Dr.Ehrenstorfer公司 )

Oasis HLB(60 mg·3 mL-1)、PRIME HLB柱

(200 mg·6 mL-1，)、C18固相萃取柱(60 mg·3 mL-1)采自Waters公司。

样品为市售婴幼儿谷物食品(米粉、荞麦面条和高粱面条)。

1.2 标准溶液的配制

称取适量各标准品，分别用甲醇溶解，配成1000 mg·L-1的单标准储备液，于-18℃ 下避光保存，有效期6个月。移取各单标准储备液，用甲醇稀释成10.0 mg·L-1的混合中间溶液，避光保存，有效期3个月。按照1.3操作方法所述制得空白样品提取液，上机前制成合适浓度的系列基质标准工作溶液。

1.3 样品前处理

准确称取2.5 g试样于50 mL离心管中，加入5 mL 80%(v/v)乙腈水溶液，匀浆2 min，超声10 min，在4℃下以10000 r·min-1离心3 min，转移全部上清液于10 mL带刻度比色管中备用。重复提取一次，合并提取液，用80%乙腈水溶液定容至10 mL，混匀备用。

取4.0 mL上清备用液于Oasis PRiME HLB柱上，流干后，收集流出液，于45℃下水浴中氮气吹干。用1.0mL0.1%(v/v)甲酸水溶液复溶，溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤后待测。

1.4 色谱条件

选用Agilent Poroshell 120EC-C18(2.7 μm，3.0 mm×75 mm)色谱柱；柱温：30℃；流动相：A为0.1%(v/v)甲酸水溶液，B为0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～0.5 min，5% B；0.5～1.0 min，10% B；1.0～3.0 min，20% B；3.0～6.0 min，50% B；6.0～8.0 min，90% B；8.1～9.0 min，5% B；流速：0.3 mL·min-1；进样量：5μL 。

1.5 质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI)，在ESI+扫描模式下检测；扫描模式为多反应离子监测(MRM)，雾化气压力：38 MPa；离子喷雾电压：4000 V；干燥气(N2)温度：350℃；干燥气流速：10 L·min-1；优化后的质谱参数见表1。

表1 3种莨菪烷类生物碱的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

比较了水-甲醇或水-乙腈组成体系中酸(甲酸、乙酸)的种类及添加比例对分离3种莨菪烷类药物的影响。实验表明：当流动相为水-乙腈时，在液相色谱分离系统中3种莨菪烷类药物上的色谱行为优于流动相为水-甲醇时。当流动相为水-乙腈时，酸(甲酸、乙酸)的添加比例在0.05%，0.1%，0.2%，0.3%条件下，目标化合物的色谱保留行为。结果显示酸添加比例在0.1%以上时，3种莨菪烷类药物的色谱行为没有太大的变化，加甲酸时各化合物响应信号更强、分离度更好、基线噪音较低。因此选择0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈作流动相。

采用选定的流动相和色谱柱，优化梯度洗脱程序，所有待测物都得到良好峰形和较高灵敏度。山莨菪碱的化学结构为莨菪酸-6β羟基-3α-莨菪酯与阿托品相比在莨菪烷母核上多了一个6β羟基，因此山莨菪碱存在四个光学异构体。消旋山莨菪碱有两个光学异构体， 所以在色谱柱上有2个色谱峰[15]。2.0μg·kg-1添加水平下，米粉中目标化合物的总离子流色谱图如图1。

配制浓度为1.0 mg·L-1的3种莨菪烷类生物碱的标准溶液，选择不同的电离模式，对各个目标物进行一级质谱扫描，结果表明各个目标化合物[M+H]+母离子相应最高。 然后对各个目标化合物进行碰撞电压、碰撞能进行优化，使选定的特征碎片离子强度达到最大。最后，对方法的喷雾电压、干燥气压力、离子源温度等参数进行了优化，最终确定各个目标化合物最佳的质谱条件，如图1，其中1为消旋山莨菪碱，2为东莨菪碱 ，3为阿托品。

图1 米粉中3种莨菪烷类药物的总离子流图

2.2 样品提取与净化条件的选择

试验比较了甲醇、乙腈作为提取试剂，对3种莨菪烷类生物碱 提取效果，结果表明乙腈较甲醇具有较高的回收率。由于莨菪烷类生物碱亲水性不同，在乙腈中加入一定比例的水可满足莨菪烷类生物碱的提取需要。本研究选用体积分数为 60%、80%、90% 的乙腈水溶液为提取试剂进行提取试验。 结果表明：当提取溶液中乙腈体积分数为 80% 时，能兼顾3种莨菪烷类生物碱的提取效率，通过2 次分步提取，3种莨菪烷类生物碱均能获得满意的提取效果，回收率为86.8%～103.3%。

谷物类植物中成份复杂， 这些物质不仅干扰LC-MS/MS分析，还会影响色谱柱的分辨率，甚至污染质谱仪。菪烷类生物碱的净化手段大多采用富集浓缩类型的 SPE方法，该类方法涉及溶剂替换、SPE柱的活化、上样、淋洗和洗脱等操作步骤，耗费时间较长。新型的亲水亲脂反相固相萃取吸附剂的Oasis PRiME HLB 可以在高比例的有机相条件下，可有效去除基质中的蛋白类、磷脂类干扰物，达到对样品进行净化的目的。按照1.3节方法获得空白米粉提

取液3份，添加10.0 μg·kg-13种莨菪烷类药物，分别取4 mL提取液通过C18、Oasis HLB和Oasis PRiME HLB小柱，收集流出液，于45℃下水浴中氮气吹干。分别用1.0mL0.1%(v/v)甲酸水溶液复溶，观察复溶液颜色，结果表明通过Oasis PRiME HLB柱净化的溶液最为清澈，且 3种莨菪烷类生物碱回收率最高，详见表2。

2.3 线性关系

对 6 份空白米粉样品进行提取净化并吹干，依次加入用 0.1%加酸水溶液配制成的 0、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg·L-1L的系列标准溶液1.0 mL，充分溶解后制得系列基质匹配标准溶液，过滤后，在选定的仪器条件下进行分析。以测得的各目标物定量离子色谱峰面积 y为纵坐标，质量浓度 xμg·L-1为横坐标，绘制标准曲线，3种莨菪生物碱在1.0～50.0 μg·L-1内呈现良好的线性关系， 相关系数(R2)均大于0.999，结果见表3。

表3 3种莨菪生物碱的基质匹配标准溶液线性方程、线性相关系数

2.4 方法的灵敏度和精密度

采用在空白米粉中添加目标化合物的方法，依据特征离子色谱峰的 S/N>3为方法的检出限， S/N>10为方法的定量限，得出阿托品、消旋山莨菪碱、东莨菪碱的检出限为 0.5 μg·kg-1，定量限为1.0 μg·kg-1。

以空白米粉为样品，制备添加 1.0、2.0、10.0 μg·kg-13个水平的样品进行测定，每个添加水平重复测定 6个样品，连续 3 d 重复操作，最终结果见表4。3种莨菪生物碱在空白米粉中的平均添加回收率为 86.8%～103.3%，日内、日间相对标准偏差(RSD)均小于10%，方法回收率和 RSD均符合实验室质量控制规范(GB/T27404-2008)的要求。

表4 米粉样品中3种莨菪生物碱添加回收率实验结果

2.5 实际样品测定

实验对30例市售米粉、荞麦面条和高粱面条进行了检测，结果表明所有样品中均未检出3种莨菪生物碱。这可能与样品的抽取数量少及样品的来源单一有关，本方法可以作为方法储备为以后的风险监测提供有力的技术保障。

3 结 语

样品用80%乙腈提取后，经固相萃取柱净化、高效液相色谱分离、串联四极杆质谱检测，成功建立了婴幼儿谷物食品中3种莨菪生物碱的检测方法。该方法具有快速简便、灵敏度高等特点，为其他植物源性食品中莨菪生物碱的检测提供了有利工具。