关于光合色素的提取、分离及其吸光度的探究

杨运昕 赵映蕾 朱冰滢 郑欢珂 朱雪滢

浙江省宁波市效实中学白杨校区(315012)

高中生物必修1进行了光合色素的提取和分离实验,通过实验观察光合色素的种类和颜色。出于对光合色素的兴趣,在查阅资料时了解到,柱层析法也可以将光合色素分离,因此进行了用柱层析法分离光合色素的实验,将柱层析与纸层析进行比较;并对光合色素提取液进行吸光度的测量,验证光合色素的功能,深化对光合色素种类、颜色和功能的理解。

1 实验原理

绿叶中的光合色素能够溶于有机溶剂而不溶于水,因此可用无水乙醇等有机溶剂提取光合色素。在色素分离的环节,因为各种色素在层析柱填充物硅胶上的吸附力不同,极性较大的物质易被硅胶吸附,极性较弱的物质不易被硅胶吸附,当采用溶剂洗脱时,发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程,吸附力较强的组分,在层析柱中移动的速度慢;吸附力较弱的组分,移动的速度快,从而形成若干色带,使各种色素相互分离。

2 材料用具

2.1 实验材料

新鲜的菠菜叶。

2.2 实验药品、试剂

无水乙醇、碳酸钙粉末、二氧化硅晶体、正己烷、氯化钠晶体、硅胶、展开剂[石油醚∶乙酸乙酯=6∶4(体积比)]、无水硫酸镁。

2.3 实验仪器

研钵、布氏漏斗、抽滤瓶、烧杯、具塞试管、圆底烧瓶、容量瓶、比色皿、循环水泵、梨形分液漏斗、洗身球、层析柱、分光光度计等。

3 探究过程

3.1 研磨

称取15 g新鲜菠菜叶,剪碎,放入研钵中,加入少量二氧化硅晶体、碳酸钙粉末和20 mL无水乙醇,充分研磨,研磨物成绿色糊状。

3.2 抽滤

准备1套干净的抽滤瓶,剪一片略小于布氏漏斗内径又能遮住漏斗内所有小孔的滤纸放在布氏漏斗底部,用少量清水润湿滤纸,打开循环水泵的开关,将抽滤瓶接到循环水泵上,滤纸随即被紧紧吸在漏斗底部,立即将研磨后的混合物倒入布氏漏斗,这时可以看到绿色的滤液被吸入抽滤瓶(见图1),漏斗内的滤渣变成了浅黄绿色(见图2)。滤渣抽干后,将抽滤瓶与循环水泵脱开,关闭水泵。

图1 用布氏漏斗进行抽滤

图2 抽滤后的浅绿色滤渣

3.3 萃取

取1套干净的100 mL分液漏斗,先检验是否漏液。将分液漏斗放置在铁圈上,抽滤瓶内的色素提取液倒入分液漏斗,加入约1 gNaCl固体,再加入10 mL正己烷,右手掌顶住漏斗顶端并握住漏斗,左手握住活塞处,大拇指压紧活塞,将分液漏斗稍稍倾斜,振荡分液漏斗,约1 min后,使漏斗上口略朝下,旋开活塞,朝斜上方无人处放出气体。如此振摇排气2～3次后,将分液漏斗放在铁圈上,静置,直到液体分层(见图3)。将下层液体从活塞口放出,上层液体从漏斗上口倒出,倒入容量瓶内,待用(见图4)。由于下层液体颜色偏深,色素含量仍然较大,将溶液倒入分液漏斗,加入10 mL正己烷,重复上述操作。将上层萃取液合并入容量瓶内。

图3 用正己烷对光合色素进行萃取

图4 萃取得到光合色素

3.4 干燥、浓缩

加1 g无水硫酸镁(干燥剂)子萃取液中,静置约5 min,干燥充分后,过滤干燥剂,滤液收集到干燥的圆底烧瓶中。减压蒸馏,至浓缩溶液约为1 mL。

3.5 填充层析柱

将层析柱下端活塞关闭,把30 g干燥的硅胶用展开剂调成浆状,然后倒入层析柱,打开活塞使溶剂流出,硅胶固体下沉,用洗耳球不停敲打层析柱,使固定相填充均匀。

3.6 色素分离

调节层析柱活塞使展开剂均匀地从下端流出,当上端展开剂的液面接近硅胶柱上端时,将浓缩后的色素提取液倒入,层析管上端放一个装有展开剂的滴液漏斗,当色谱将要完全渗入层析柱的时候,打开滴液漏斗,并调节流速,使层析柱上端一直保持一定的液面高度(见图5)。

图5 开始柱层析

光合色素逐渐在层析柱上发生分离,分离出不同的色带(见图6),当色带移动到层析柱底部的时候,用干净的比色皿接流出的溶液,不同的色带流出时更换不同的比色皿。

3.7 分光光度法检测

圆底烧瓶内剩余的少量色素浓缩液用展开剂稀释,然后以展开剂为参照,在可见光范围内测量吸光度。

4 探究结果

层析柱上色带的移动速度及色带的延展宽度见表1。

表1 光合色素的种类与移动速度、颜色、色带的延展宽度

收集到的各种色素溶液如图7所示。

图7 收集到的各种色素溶液

光合色素提取液在不同波长(λ)下的吸光度(A)数值见表2,对应的吸光度曲线如图8所示。

表2 光合色素提取液在不同波长下的吸光度值

图8 光合色素提取液的吸光度曲线

5 讨论分析

层析柱上色带的数目多于纸层析法分离的结果,且颜色顺序与纸层析法获得的结果不完全相同。文献显示,除叶绿素外,叶绿体中还有许多种黄色、 橙色和红色的色素,合称为类胡萝卜素,其中最多的是胡萝卜素和叶黄素[1],由于柱层析的分离效果较好,这些色素在层析柱上进一步分离,所以呈现更多的色带。影响色素在层析柱上移动结果的实验因素有很多,如研磨中加入的辅助试剂、萃取剂、展开剂、层析柱的填充材料等,我们分析导致各色素在层析柱和滤纸上展开顺序有差异的主要原因是层析柱的填充材料与滤纸材料不同,对色素的吸附能力不同。当然这仍需要进一步的实验才能得出准确结论。

从图8中可见,光合色素对波长400～500 nm范围内的蓝紫光和620～680 nm范围内的红橙光有较强吸收能力,而对在波长为500～600 nm范围内的绿光没有吸收或吸收很弱。所以,植物最喜欢的光是红橙光和蓝紫光。

对比纸层析和柱层析分离色素,两种分离方法各有优势。纸层析的方法需要的实验器材简便,操作简单,可以用于简单的色素分离[2]。柱层析分离操作相对复杂,但是分离的效果更好,且可以用于大量色素的提取和制备中。