肉松中单核细胞增生李斯特氏菌的检测及分析

◎ 韩珍珍

（运城市综合检验检测中心，山西 运城 044000）

单核细胞增生李斯特菌简称单增李斯特菌，革兰氏阳性细菌，是引起肉类食物中毒的重要病原菌。单核细胞增生李斯特菌能在低氧、4 ℃冷藏、-18 ℃冷冻下长时间存活[1-2]，是冷藏食品中一种严重的食源性致病菌。其广泛存在于自然界中。单增李斯特菌中毒通常与食物污染有很大关系，尤其是预包装即食食品被污染。晏许超等[3]指出即食食品较易被单增李斯特菌感染，需要加强对即食食品进行检测监管。因此本文针对肉松类即食食品进行此菌的检测分析，希望为其他实验室及政府制定食品安全制度提供支持。

1 材料与方法

1.1 样品

从各县市超市、农贸市场抽取零售散装的猪肉松、鸡肉松、牛肉松共167份，所有样品均用无菌采样袋密封包装，在接近原储存温度下尽快送达实验室。

1.2 主要仪器

BM-20AY落射荧光显微镜带照相系统（上海光学仪器），BHC-1300Ⅱ生物安全柜（苏净集团），生化培养箱（上海博迅），VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统（法国生物梅里埃公司），浊度仪（法国生物梅里埃公司），均质器（浙江泰林）等。

1.3 菌株与试剂

菌株：阳性菌株为单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC19114）；对照菌株为金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、马红球菌（ATCC6939）、英诺克李斯特氏菌（ATCC33090）、伊氏利斯特氏菌（ATCC19119）和斯氏李斯特氏菌（ATCC35967）。

试剂：李氏增菌肉汤LB（1907134）、PALCAM琼脂（190412）、5%～8%羊血琼脂（190525）、单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定试剂盒（190706）、李斯特氏菌显色培养基（190525）均为北京陆桥；GP鉴定卡。

1.4 检测方法

本试验根据GB 4789.30—2016标准方法进行单核细胞增生李斯特菌的检验。共取样品n=5进行检验，依次编号为01～05，共5组，每组做2个平行，步骤依次为增菌、分离、鉴定（生化鉴定和全自动生化鉴定仪）、计数。此次检测前对实验室的环境及关键培养基及菌种进行验证，确保试验准确。

2 结果与分析

2.1 肉松中单核细胞增生李斯特氏菌的检出情况

167份散装肉松食品检测中，共检出2批猪肉松中有单核增生李斯特菌，其中农贸市场检出1份，检出率为3.45%；网购产品检出1份，检出率为4.00%。鸡肉松和牛肉松中均未检出该菌。不同肉松食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检出率结果，如表1所示。

表1 不同肉松食品种单核细胞增生李斯特氏菌的检出率表

2.2 生化鉴定过程

2.2.1 可疑菌落选取及鉴定

挑取PALCAM平板上有黑色晕圈的黑色菌落及显色平板上有白色晕圈的小圆形蓝绿色菌落，分别划线接种于营养琼脂平板，做纯培养再进行确证试验。由图1可知，经革兰氏染色，该菌为革兰氏阳性菌，短杆菌；有动力，呈伞状生长；过氧化氢酶呈阳性反应。

图1 革兰氏染色、动力试验、过氧化氢酶试验图

2.2.2 溶血试验及协同溶血试验（cAMP）

由图2可知，溶血试验中，D、S、y菌种在刺种点周围产生溶血环；阴性菌无溶血环。其中从营养琼脂平板中选取的5个可疑菌落（每个菌落两个平行）做溶血试验，菌落分别为1a1b；2a2b；3a3b；4a4b；5a5b，5个菌落都出现透亮的溶血现象。协同溶血试验（cAMP）中，可疑菌落在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强，斯氏李斯特氏菌的溶血也增强，这两种菌均出现协同溶血现象，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。自此可以初步确定可疑菌落有溶血和协同溶血现象，此现象与单核细胞增生李斯特氏菌相同。

图2 溶血试验和协同溶血试验图

2.2.3 生化试剂盒及全自动生化鉴定仪鉴定

从营养琼脂平板上挑取目标菌落，先利用浊度仪制成0.5 McF浓度的菌悬液，再用GP鉴定卡参照操作说明进行操作，采用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪鉴定，结果为单增李斯特氏菌（98%）。

3 结论与讨论

单核细胞增生李斯特菌按照GB 4789.30—2016检验，检验过程中的分离培养和菌种鉴定至关重要。①观察菌落形态挑取关键可疑菌株，选取独立区域的单个菌落，避免挑取多个菌落。②总结菌落形态特征也很重要，如在选取李斯特氏菌显色平板上可疑菌落时，可以根据经验排除部分蓝绿色菌落，比如周围无晕圈的蓝绿色小菌落（英诺克李斯特氏菌）[4-5]。③在生化鉴定中，为了防止假阳性，要选择木糖阴性、鼠李糖阳性的典型菌落进行纯化培养后再鉴定。本试验用两种方法对目标菌株进行生化鉴定，即溶血及协同溶血试验与生化试剂盒及全自动生化鉴定仪。普通生化鉴定试验操作比较烦琐，费时费力，不能快速满足检测需求，溶血试验、协同溶血试验对检验人员要求比较高，不易操作。但全自动生化鉴定仪比较简便快捷，准确率也比较高，对人员要求不高，在操作和快捷方面表现优异，在实际监测中，为了结果准确可靠，避免假阴性出现，可同时应用两种鉴定方法。

本文通过对散装肉松食品进行检测，分析发现比较典型的是农贸市场的猪肉松单增李斯特菌检出率为3.45%。研究还发现采样地点对此菌检出有影响，超市产品无单增李斯特菌检出，但农药市场及网络产品中均有此菌检出，说明农贸市场和网站相对于超市有污染的潜在风险，此经营场所环境比较复杂且人流动性比较大，因是散装食品，在加工、储存、运输、销售、再加工及二次分装过程中都有交叉污染及二次污染的可能性[6]。此次采集肉松发现农贸市场的一些摊位食品安全存在隐患，主要是来源不明且商贩无销售资质，储存的容器比较简陋，生熟不分，通风，保存、消毒环节不完善。笔者建议农贸市场散装肉松储存由政府加强监管，规定统一盛放的容器，使用光滑不易附着细菌的容器[7]，有利于降低产品的风险。对于网站食品则主要是监管存在漏洞，主要依赖于网络，食品交易存在虚拟性和不可考证性，一些网络不良商家以次充好，出售保质期将近到期的产品；一些小作坊加工的食品卫生条件也无保证，更无食品标示，这样给消费者的售后和维权带来极大不便。针对这些问题，政府应该进一步加强对食品来源、流通、加工、销售、储存、处理等主要环节的监管及规范管理，尤其是农贸市场和网站食品的监管，警戒食源性疾病的发生和流行[8]，改善人们的食品安全，提高生活质量。