温针结合电针对卵巢早衰大鼠血清性激素及炎症因子的影响

张琴，嵇波，谢亚娜，牟秋杰，赵国桢，徐塽，刘翼天，石天宇，葛云鹏，韩娜娜，张靖宇，刘玉婷

1.北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029；2.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40 岁以前出现雌二醇（estradiol，E2）降低和卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）升高，导致不孕及生殖器官萎缩的一种疾病[1]。目前西医主要以激素替代疗法缓解绝经症状，以辅助生殖技术解决生殖问题，但不良反应明显[2]。临床研究发现，针灸能有效调节生殖内分泌环境，可在一定程度上延缓卵泡闭锁，改善卵巢功能[3]。针灸治疗，穴位是基础，方法是关键。分析既往研究发现，临床多从手针、电针、温针等入手，涉及穴位覆盖关元、三阴交、肾俞等[4]，但对不同针刺方法的配合及穴位配伍的机制研究甚少。因此，本实验以温针“关元”结合电针“三阴交”，从免疫炎性和内分泌角度探讨针刺对POF 大鼠卵巢功能的影响，旨在为针灸防治POF 提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物

10 周龄SPF 级雌性SD 大鼠32 只，体质量（250±20）g，北京斯贝福生物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2019-0010。饲养于室温（24±1）℃、相对湿度50%～60%屏障系统，12 h 明暗交替，自由摄食饮水。适应性喂养4 d 后，每日8:00－9:00 对大鼠阴道脱落细胞进行涂片处理，连续观察7 d，选择动情周期规律的大鼠作为实验对象。实验动物处理经北京中医药大学实验动物伦理委员会审查批准（BUCM-4-2019110802-4038）。

1.2 药物

雷公藤多苷片，湖南千金协力药业有限公司，批号20190417，10 mg/片；结合雌激素片，0.625 mg/片，新疆新姿源生物制药有限责任公司，批号20190304。

1.3 主要试剂与仪器

FSH ELISA 试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，货号ml059034-J；E2ELISA 试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，货号ml002891-J；抗苗勒氏管激素（AMH）ELISA 试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，货号ml003371-J；干扰素-γ（INF-γ）免疫组化试剂盒，美国Proteintech 公司，货号15365-1-AP；白细胞介素-4（IL-4）免疫组化试剂盒，美国Proteintech公司，货号66142-1-lg。0.20 mm×13 mm 一次性华佗牌无菌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司），HT-2 型温针电针综合治疗仪（常州华音电子有限公司），二导HAN’s 穴位刺激仪（北京华卫产业开发有限公司，型号LH202H），低温离心机（德国Eppendorf 公司，型号Centrifuge 5810R），微孔板检测系统（美国Molecular Devices 公司，型号Spectra Max M2），全玻片扫描系统（日本OLYMPUS 公司，型号VS200）。

1.4 分组、造模及干预

将实验大鼠随机分为对照组、模型组、针刺组和药物组，每组8 只。除对照组外，其余组大鼠每日8:30给予雷公藤多苷75 mg/kg 灌胃，每日1 次，连续14 d，制备POF 模型[5]。自造模第8 日起，连续7 d，每日7:50 取大鼠阴道脱落细胞行美蓝染色，镜下观察大鼠动情周期变化。若出现动情周期紊乱、动情间期延长、动情期消失等为造模成功[6]。

造模结束后（第15 日开始），对照组和模型组每日抓取固定20 min，针刺组每日进行温针、电针，取穴参照《实验针灸学》[7]，分别针刺“三阴交”“关元”。“三阴交”直刺0.5 mm，接穴位刺激仪负极，在“三阴交”上方2 mm 处针刺入皮，连接正极，电流强度0.5 mA，频率2/15 Hz，时间20 min。“关元”朝子宫方向平刺1 cm，接温针仪，打开加热功能，时间20 min。药物组每日予结合雌激素灌胃，给药剂量0.075 mg/kg。共干预28 d，第29 日麻醉大鼠，行腹主动脉采血，并取卵巢组织。

1.5 指标检测

1.5.1 动情周期

治疗第14～28 日，每日8:00－9:00 行大鼠阴道脱落细胞涂片美蓝染色，观察动情周期变化。

1.5.2 卵巢指数

大鼠腹主动脉取血后迅速取卵巢组织，去除表面脂肪组织，称量湿重并记录。计算卵巢指数（卵巢湿重÷末次体质量×100%）。

1.5.3 HE 染色

称重后将左侧卵巢组织迅速放入4%多聚甲醛固定液，固定48 h，常规石蜡包埋、切片（厚度4 μm），按照HE 染色试剂盒说明书染色，镜下观察卵巢组织及卵泡形态。

1.5.4 血清雌二醇、卵泡刺激素及抗苗勒氏管激素含量

将腹主动脉血室温静置2 h，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。实验按照ELISA 试剂盒说明书进行操作，检测血清E2、FSH 和AMH 含量。

1.5.5 卵巢组织干扰素-γ 和白细胞介素-4 蛋白表达

每只大鼠随机选择2 张石蜡切片，置于70 ℃恒温烤箱烘烤30 min，脱蜡、水化，于修复液中进行微波加热修复，H2O2溶液封闭10 min，山羊血清封闭80 min，按照免疫组化试剂盒说明书进行抗体孵育、染色、脱水、封片，镜下随机选择2 个视野观察。

1.6 统计学方法

采用SAS9.4 统计软件进行分析。计量资料以表示，多组比较符合正态分布且方差齐用方差分析，两两比较用LSD法；计数资料用Fisher’s 精确概率法。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阴道脱落细胞涂片分析

阴道脱落细胞在动情前期多为椭圆形有核上皮细胞，动情期为片状无核角化细胞，动情后期为大量白细胞和少量无核角化细胞，动情间期有白细胞、有核上皮细胞、片状角化细胞。与对照组比较，模型组大鼠动情周期紊乱率显著上升（P＜0.01）；与模型组比较，针刺组和药物组大鼠动情周期紊乱率显著下降（P＜0.05）。见图1、表1。

图1 大鼠阴道脱落细胞涂片（美蓝染色，×20）

表1 各组大鼠动情周期变化比较

2.2 针刺对模型大鼠卵巢指数的影响

与对照组比较，模型组大鼠卵巢指数显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，针刺组大鼠卵巢指数显著升高（P＜0.05），药物组大鼠卵巢指数有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与药物组比较，针刺组大鼠卵巢指数未见明显差异（P＞0.05）。见图2。

图2 各组大鼠卵巢指数比较（，每组8 只）

2.3 HE 染色结果

对照组大鼠卵巢结构正常，可见原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡，黄体较多，分布均匀。与对照组比较，模型组卵巢组织松散，卵泡排列紊乱，结缔组织增多，初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡明显减少，闭锁卵泡增加；与模型组比较，针刺组和药物组大鼠卵巢组织相对紧实致密，次级卵泡增加，窦卵泡增多，黄体均匀，闭锁卵泡减少。见图3。

图3 各组大鼠卵巢组织形态（HE 染色，×4）

对照组细胞排列整齐，细胞核清晰圆润，颗粒细胞层丰厚，可见清晰卵子细胞核、透明带和放射冠；模型组较对照组细胞排列不均，细胞核边缘界限不清，卵泡形态不规则，颗粒细胞逐渐溶解，卵泡内卵子丢失，未见透明带与放射冠；针刺组较模型组细胞排列整齐，细胞核边界清晰，周围基质细胞层次分明，颗粒细胞层较厚，可见透明带；与模型组比较，药物组细胞排列较整齐，细胞核边界较清晰，颗粒细胞层增多，但排列稍显不均。见图4。

图4 各组大鼠卵泡形态（HE 染色，×40）

2.4 针刺对模型大鼠血清雌二醇、卵泡刺激素及抗苗勒氏管激素含量的影响

与对照组比较，模型组大鼠血清E2、AMH 含量显著减少（P＜0.05，P＜0.01），FSH 含量显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，针刺组和药物组大鼠血清AMH、E2含量显著增加（P＜0.05），FSH 含量显著减少（P＜0.01）；针刺组与药物组差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

图5 各组大鼠血清E2、AMH、FSH 含量比较（，每组8 只）

2.5 针刺对模型大鼠卵巢组织干扰素-γ 和白细胞介素-4 蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠卵巢组织IFN-γ 蛋白表达显著升高（P＜0.01），IL-4 蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，针刺组、药物组大鼠卵巢组织IFN-γ 蛋白表达显著降低（P＜0.01），IL-4 蛋白表达显著升高（P＜0.01，P＜0.05）；针刺组与药物组比较未见明显差异。见图6～图8。

图6 各组大鼠卵巢组织IFN-γ 阳性表达（免疫组化染色，×40）

图7 各组大鼠卵巢组织IL-4 阳性表达（免疫组化染色，×40）

图8 各组大鼠卵巢组织IL-4、IFN-γ 蛋白表达比较（，每组8 只）

3 讨论

POF 属中医学“血枯”“血隔”“闭经”“不孕”等范畴，病因是“天癸早竭”[8]。《素问•上古天真论篇》有“二七而天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下，故有子……七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也”。女子生育功能与任脉盛衰息息相关，任脉虚是POF 的致病关键，但造成“未老先衰”最根本的原因是气血亏虚，尤以精血亏虚为主，从而导致形容枯槁、经水断绝。

针灸治疗中穴位选择和针刺方法是决定疗效的重要因素。三阴交为足三阴经交会穴，承接三条阴经之气，刺激三阴交不仅可健脾，还可疏肝益肾[9]，进而益精旺血。研究表明，电针“三阴交”可调节卵巢激素水平及卵泡的生长发育状态[10-11]，以达到延缓卵巢衰老的作用。关元是任脉和足三阴经的交会穴，温针的热量可通过针体传递，深入至组织内部并向周围扩散，具有行气活血、温经通络、振奋阳气等作用[12-13]，能有效培肾固本、调理冲任、温通胞宫。本实验结果表明，温针“关元”结合电针“三阴交”能调整POF 大鼠动情周期，改善卵巢形态，这可能与其益精固本、温通冲任的作用相关。

POF 对卵巢内环境最直观影响体现在E2水平降低与FSH 水平升高。E2由卵泡分泌，是主要的类固醇激素，能促进卵泡早期发育[14]，协同FSH 促进卵泡膜细胞和颗粒细胞膜上合成黄体生成素受体，促进颗粒细胞增殖和分化[15]。FSH 是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种糖蛋白激素，主要功能是促进卵泡的发育和成熟，激活卵巢颗粒细胞内的芳香化酶[16-17]，促进E2合成与分泌，并且参与调节优势卵泡的选择与进一步发育。FSH 与E2水平能高度反映卵巢功能，但二者均随月经周期而改变，稳定性差。La Marca 等[18]发现，AMH 在整个月经周期呈相对稳定状态，或许能作为确定卵巢储备的标志物[19]。AMH 主要由颗粒细胞分泌，开始表达于初级卵泡，在次级卵泡和小窦卵泡中达到峰值[20]，具有抑制FSH 的功能[21]，是目前发现的体内唯一可调控卵泡募集的细胞因子，对卵泡的生长发育及优势卵泡的选择起重要作用。本研究显示，温针“关元”结合电针“三阴交”能显著提高POF 大鼠血清E2、AMH 含量（P＜0.05），降低血清FSH 含量（P＜0.01），改善大鼠内分泌环境，提高卵巢储备，对POF 大鼠卵巢功能有良性调节作用。

IFN-γ 是Th1 细胞分泌的具有代表性的细胞因子，能促进细胞免疫，Th2 细胞分泌的代表性因子IL-4主要介导体液免疫，Th1、Th2 细胞通过各自分泌的细胞因子相互制约。既往研究显示，IFN-γ 增多最终可导致卵巢功能异常[22]，而IL-4 可抑制该反应。IL-4和IFN-γ 是影响卵巢免疫炎性反应的重要细胞因子，IFN-γ 作为典型的促炎因子，能活化单核、巨噬细胞并增强溶菌酶活性。研究发现，POF 患者血清IFN-γ水平升高[23]，POF 大鼠卵巢组织IFN-γ 蛋白与mRNA表达均升高[24]。IFN-γ 还存在于卵泡液中，在大鼠原始卵泡、初级卵泡及次级卵泡的卵泡内膜细胞呈强阳性反应，在成熟卵泡内膜细胞则呈弱阳性反应[25]。IL-4 作为抗炎因子，能拮抗IFN-γ 的作用，它最初由Howard等[26]确定为B细胞的伴生因子，随后证实IL-4在生理和病理条件下都在白细胞存活中起重要作用[27-28]，如Th2 细胞介导的体液免疫。IL-4 在对抗与年龄相关的促炎变化方面有潜在的作用，然而炎症本身是否源于缺乏IL-4 信号尚不清楚[29]。本研究发现，温针“关元”结合电针“三阴交”能有效降低促炎因子IFN-γ 蛋白表达（P＜0.01），提高抗炎因子IL-4 蛋白表达（P＜0.01）。我们推测针刺通过提高IL-4 的表达，诱导Th0 向Th2 转化并抑制IFN-γ 促炎作用，调控Th1/Th2 比值，使细胞免疫与体液免疫达到平衡，从而降低卵巢组织炎性反应，对卵巢起到保护作用。

综上所述，本研究提示温针“关元”结合电针“三阴交”可调节POF 大鼠生殖内分泌环境，降低卵巢炎性反应，从而改善卵泡发育，恢复卵巢形态，提高卵巢储备能力，具有改善POF 的作用。