基于TLR4/NF-κB信号通路的降尿酸方对尿酸性肾病大鼠肾功能和尿酸盐结晶的影响

李东东，刘伟伟，周子正，王传旭，吴燕升，郭亚芳，高建东

1.上海中医药大学附属曙光医院，上海中医药大学中医肾病研究所，上海中医药大学肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海市中医临床重点实验室，上海 201203；2.上海中医药大学附属第七人民医院，上海 200134；3.上海市浦东医院，上海 201399

尿酸引起的肾损伤包括急性尿酸盐肾病、慢性尿酸盐肾病和尿酸肾结石[1]，尿酸肾损伤主要由尿酸和/或尿酸盐结晶在肾脏沉积而引起的氧化应激、炎症、内皮功能障碍等所致[2]。高尿酸血症与多种肾脏病相关，也是导致慢性肾脏病进展的重要因素[3]。尿酸作为损伤相关分子模式的一种，可被固有免疫系统的Toll 样受体（TLR）识别。TLR4 是细胞膜上一种模式识别受体，激活后可启动下游核因子-κB（NF-κB）反转录，从而激活炎症信号通路，通过上调肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子水平，引起炎症反应[4]。研究显示，TLR4/NF-κB 参与尿酸引起的肾脏损伤[5-6]。尿酸性肾病（UAN）病机为痰湿瘀血互结，与肾小管间质炎症相关[7-8]。降尿酸方是上海中医药大学附属曙光医院临床验方，具有化痰祛湿散结之效。研究表明，其可降低UAN 患者血尿酸（SUA），改善肾功能[9]。本研究制备UAN大鼠模型，从TLR4/NF-κB 信号通路观察降尿酸方对UAN 大鼠肾功能和尿酸盐结晶的影响，揭示其机制。

1 实验材料

1.1 药物及制备

降尿酸方（酒大黄10 g，粉萆薢10 g，炒王不留行10 g，威灵仙10 g，炒车前子15 g，炒芥子10 g，山楂10 g），饮片由上海康桥中药饮片有限公司提供，加水煎煮2 次，合并药液，浓缩至含原药材1.6 g/mL。别嘌醇缓释胶囊，黑龙江澳利达奈德制药有限公司，批号18030901，250 mg/粒，配制成2.5 mg/mL 溶液。

1.2 动物

SPF 级雄性SD 大鼠32 只，体质量（190±20）g，北京维通利华实验动物有限公司提供，动物许可证号SYXK（沪）2014-0006，伦理号PZSHUTCM190315029。饲养于上海中医药大学动物实验中心，温度25 ℃，相对湿度45%，光/暗12 h 交替，自由摄食饮水。

1.3 主要试剂与仪器

氧嗪酸钾（山东中科泰斗有限公司，批号080601），腺嘌呤（印度BioBharati Life Science 公司，批号EB27BA0015），蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号P0011），PVDF 膜（美国Milipore，货号R4CA33126），兔抗大鼠TLR4 一抗（武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号A5258），兔抗大鼠NF-κB p65 一抗（美国CST 公司，货号8242），兔抗大鼠TNF-α 一抗（英国Abcam 公司，货号ab6671），β-actin 小鼠单克隆抗体（美国Proteintech公司，货号66009），HRP 标记山羊抗小鼠IgG（上海碧云天生物技术有限公司，货号A0216），山羊抗兔IgG（上海碧云天生物技术有限公司，货号A0208），大鼠TNF-α ELISA 检测试剂盒（杭州联科生物技术有限公司，货号EK382/3-02），大鼠IL-6 ELISA 检测试剂盒（杭州联科生物技术有限公司，货号EK306/3-01）。自动组织脱水机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，KD-TS3A），生物组织包埋机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，KD-BM），摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，KD-P），烘片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，KD-H），透射电子显微镜（德国FEI 公司，Tecna G2 Bio TWIN），电泳仪、电源仪、垂直式蛋白电泳槽、湿转膜仪（美国Bio-Rad 公司）。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药

大鼠适应性喂养1 周后，随机分为正常组、模型组、别嘌醇组和降尿酸方组，每组8 只。参考文献[10]方法造模，实验开始第1 日，除正常组外，其余各组大鼠上午给予氧嗪酸钾（1.5 g/kg）和腺嘌呤（0.1 g/kg）混合液灌胃，灌胃体积10 mL/kg，正常组给予等体积灭菌蒸馏水。造模药应用至少4 h 后，降尿酸方组和别嘌醇组分别按16 g/kg、25 mg/kg 剂量给予相应药液（相当于60 kg 成人临床用药剂量6 倍）灌胃，给药体积10 mL/kg，正常组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。造模与给药同时进行，连续4 周。

2.2 样本收集

给药结束后，麻醉大鼠，腹主动脉取血，分离右肾，置于-80 ℃冰箱保存。另在冰上迅速取左肾，切取3 块1 mm×1 mm×1 mm 大小肾皮质组织，放入2.5%戊二醛固定液中，4 ℃避光保存，样品送至上海中医药大学电镜室观察肾组织超微结构。SUA、血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）和24 h 尿蛋白（UTP）送至上海中医药大学附属曙光医院检验科检测。

2.3 血清肿瘤坏死因子-α 和白细胞介素-6 含量检测

严格按ELISA 试剂盒说明书进行操作，于酶标仪波长450 nm 处测定各孔OD 值，计算血清TNF-α、IL-6 含量。

2.4 病理观察

冰上取肾组织，90%乙醇固定，室温摇床放置24 h；梯度乙醇脱水；石蜡包埋，切片（4 μm），60 ℃烤片1 h。使用前将切片脱蜡至水，HE、Masson 和六胺银染色，中性树胶封片，镜下观察肾组织病理变化和尿酸盐结晶沉积情况，电镜观察肾组织超微结构。

2.5 免疫组化检测

取肾组织切片，37 ℃烤片1 h，梯度乙醇脱水，微波修复，10%BSA 封闭1 h，加TNF-α 一抗（1∶50）、4 ℃孵育过夜，加入HRP 标记二抗，室温孵育1 h，DAB 显色，中性树胶封片，计算TNF-α 阳性表达的平均光密度。

2.6 Western blot 检测

取20 mg 大鼠肾组织，加入200 μL RIPA 裂解液，匀浆机充分研磨，BCA 法测定蛋白浓度，95 ℃金属浴10 min；取10 μg 蛋白上样，SDS-PAGE 电泳；蛋白转至PVDF 膜，5%脱脂牛奶封闭2 h；分别加入TLR4（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）一抗，4 ℃孵育过夜；PBST 洗涤3 次，滴加HRP 标记二抗（1∶1 000），室温孵育1 h；PBST 洗涤3 次，ECL 化学发光液孵育30 s，全自动凝胶成像系统拍照观察，计算目的蛋白条带灰度值。

3 统计学方法

采用SPSS22.0 统计软件进行分析。实验数据以表示，多组间比较用方差分析，不符合正态分布或方差不齐时用非参数检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 降尿酸方对模型大鼠血尿酸、血肌酐、血尿素氮和24 h 尿蛋白的影响

与正常组比较，模型组大鼠SUA、SCr、BUN 和24 h UTP 水平均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）；与模型组比较，降尿酸方组和别嘌醇组大鼠SUA、BUN 和24 h UTP 水平均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表1。

表1 各组大鼠SUA、SCr、BUN、24 h UTP 水平比较（）

表1 各组大鼠SUA、SCr、BUN、24 h UTP 水平比较（）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

4.2 降尿酸方对模型大鼠血清肿瘤坏死因子-α 和白细胞介素-6 含量的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6 含量明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，降尿酸方组和别嘌醇组大鼠血清TNF-α、IL-6 含量明显减少（P＜0.01）。结果见表2。

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6 含量比较（，pg/mL）

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6 含量比较（，pg/mL）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

4.3 降尿酸方对模型大鼠肾组织病理形态的影响

HE、Masson 染色和透射电镜观察显示，与正常组比较，模型组大鼠肾小管管壁变薄，管腔扩张，局灶性炎症细胞浸润，肾间质纤维化；肾小管上皮细胞线粒体数目减少，形态肿胀，结构模糊，有空泡形成，线粒体嵴排列紊乱或消失。与模型组比较，降尿酸方组和别嘌醇组大鼠肾组织损伤有所改善，线粒体形态恢复正常，结构清晰。见图1～图3。

图1 各组大鼠肾组织形态（HE 染色，×200）

图2 各组大鼠肾组织形态（Masson 染色，×200）

图3 各组大鼠肾组织超微结构

六胺银染色结果显示，与正常组比较，模型组大鼠肾组织有大量尿酸盐结晶沉积（P＜0.01），尤其是肾小管区域；与模型组比较，降尿酸方组和别嘌醇组大鼠肾组织尿酸盐结晶明显减少（P＜0.01）。见图4。

图4 各组大鼠肾组织尿酸盐结晶比较（六胺银染色，，每组8 只）

4.4 降尿酸方对模型大鼠肾组织Toll 样受体4、核因子-κB p65、肿瘤坏死因子-α 蛋白表达的影响

模型组较正常组大鼠肾组织TLR4、NF-κB p65、TNF-α 蛋白表达升高（P＜0.01，P＜0.05）；与模型组比较，降尿酸方组和别嘌醇组大鼠肾组织TLR4、NF-κB p65、TNF-α 蛋白表达降低（P＜0.05）。见图5、表3。TNF-α 免疫组化结果与Western blot 一致。见图6。

表3 各组大鼠肾组织TLR4、NF-κB p65、TNF-α 蛋白表达比较（）

表3 各组大鼠肾组织TLR4、NF-κB p65、TNF-α 蛋白表达比较（）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

图5 各组大鼠肾组织TLR4、NF-κB p65、TNF-α 蛋白免疫印迹图

图6 各组大鼠肾组织TNF-α 阳性表达（免疫组化染色，，每组8 只）

5 讨论

UAN 是可溶性尿酸盐或尿酸盐结晶沉积导致的肾脏损伤性疾病，目前治疗以抑制尿酸生成、促进尿酸排泄和尿酸盐结晶溶解为主。别嘌醇可抑制肝脏黄嘌呤氧化酶活性，减少尿酸生成，减轻肾脏炎症和病理损伤，改善肾功能。本实验结果显示，降尿酸方可降低大鼠SUA、SCr、BUN、24 h UTP、TNF-α 和IL-6水平，改善肾功能。HE、Masson 染色和透射电镜观察表明，降尿酸方可减轻UAN 大鼠肾脏病理损伤，减轻肾间质纤维化，保护肾小管上皮细胞。肾脏尿酸盐结晶阻塞肾小管是急性尿酸肾损伤的主要原因[11]。本实验中偏振光显微镜下可见UAN 大鼠肾脏有大量尿酸盐结晶沉积，主要聚集在肾小管，别嘌醇和降尿酸方治疗后，尿酸盐结晶沉积相对减少，其中别嘌醇疗效更为显著。

尿酸作为危险相关分子模式的一种，可激活TLR4/NF-κB 信号通路，引起炎症反应。本实验中，经降尿酸方治疗后，大鼠肾组织TLR4、NF-κB p65、TNF-α 蛋白表达降低，表明降尿酸方可抑制TLR4/NF-κB 信号通路激活，降低TNF-α 表达，减轻肾脏炎症。Yang 等[12]研究发现，五苓散可抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路，减轻尿酸引起的炎症损伤。单佳铃等[13]研究表明，短穗兔耳草提取物对尿酸钠诱导的急性痛风性关节炎大鼠有一定的保护作用，其机制可能与TLR/MyD88/NF-κB 信号通路相关。据此我们推测，降尿酸方减轻肾脏炎症可能与抑制TLR4/NF-κB 信号通路、降低TNF-α 表达相关。

中医认为，UAN 形成多为先天禀赋不足，气血运行不畅，停滞为瘀，聚而生痰，痰瘀互结，邪伤于肾；后天多食肥甘厚腻，或年过不惑，脏气衰退，伤及脏腑，久必及肾所致。有学者认为，痰瘀互结是炎症发生的实质[14-16]。降尿酸方以炒王不留行祛痰通络，炒车前子利水祛痰，炒芥子化痰散结，配山楂活血化瘀以止痛，粉萆薢、威灵仙可祛风胜湿、通络止痛，酒大黄通二便直达下焦，深入血分，无坚不破，荡涤积垢，诸药合用，以达活血通络、化痰降浊之功。综上，降尿酸方可改善UAN 大鼠肾功能，减少尿酸盐结晶沉积，减轻肾脏损伤，其机制可能与抑制TLR4/NF-κB 信号通路相关，其具体机制有待进一步研究。