化生性乳腺癌免疫微环境中中性粒细胞浸润和PD-L1表达及临床病理意义

胡 月，程岚卿，王 弦,2，王志皓，吴 强,2

化生性乳腺癌(metaplastic breast cancer, MBC)是一组异质性肿瘤，其特征是肿瘤性上皮向鳞状细胞和(或)间叶样成分分化，包括但不限于梭形细胞、软骨样和骨样细胞[1]。MBC往往伴有浸润性导管癌非特殊型(invasive ductal carcinoma of no special type, IDC-NST)成分。目前对于MBC的化生亚型与预后的关系仍存在争议。MBC整体生存率不佳，容易出现局部复发与远处转移，且目前尚无有效的预后指标[2]。

本课题组前期研究显示，乳腺癌中肿瘤相关中性粒细胞(tumor-associated neutrophils, TANs)浸润与乳腺癌患者无瘤生存期呈负相关[3]。既往研究发现，胃癌中肿瘤衍生的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子通过Janus激酶(JAK)信号转导因子和转录激活因子3(STAT3)信号通路，激活胃癌中浸润的中性粒细胞，并表达高水平细胞程序性死亡-配体1(programmed cell death-ligand 1, PD-L1)，进而抑制正常T细胞免疫反应，并且在体内促进胃癌的生长和发展[4]。MBC中尚无关于TANs和PD-L1相关性的研究，因此，本实验利用免疫组化法检测MBC中TANs的浸润情况与PD-L1的表达，分析TANs和PD-L1表达的关系，探究TANs与PD-L1在MBC中的作用及其临床病理意义。

1 材料与方法

1.1 材料收集2011～2020年安徽医科大学第一附属医院和安徽医科大学第二附属医院存档的47例MBC手术切除标本，所有患者术前均未行新辅助化疗，并经复查核实。所有肿瘤诊断标准参照WHO(2019)MBC组织学分型。根据肿瘤成分类型分类：鳞状细胞癌22例、梭形细胞癌5例、低级别腺鳞癌1例、伴异源性间叶样分化型9例、混合型10例(含两种及两种以上化生成分)。此外，47例MBC中同时具有化生成分和NST成分有41例。MBC患者中位年龄51.6岁。对患者进行随访，每半年随访1次，随访方式为查询门诊病历或电话随访。当患者出现肿瘤转移、复发或死亡等事件时作为随访终点，随访截至2020年8月。

1.2 试剂鼠抗人CD66b单克隆抗体(G10F5，BD Pharmingen公司)，抗人PD-L1兔单克隆抗体(SP142，Abcam公司)，小鼠/兔聚合法检测通用性试剂盒(北京中杉金桥公司、美国罗氏公司)，DAB显色试剂盒(北京中杉金桥公司、美国罗氏公司)。

1.3 方法所有组织均经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋。蜡块经4 μm厚连续切片，分别行HE和免疫组化染色。应用CD66b标记TANs，采用EnVision两步法进行免疫组化染色；通过Roche BenchMark XT全自动免疫组化仪半抗原及Optiview增强放大系统对癌组织进行PD-L1染色。

1.4 结果判读免疫组化结果判读由两名病理医师采用双盲法对染色切片进行全面观察，判读结果取平均值。TANs计数[3]：以中性粒细胞胞膜及胞质强染色为阳性，计数10个高倍镜视野MBC中化生成分癌实质浸润的CD66b阳性中性粒细胞总数作为其浸润密度。以TANs浸润密度的中位数作为区分TANs浸润高、低密度的指标。PD-L1判读[5]：以细胞膜及细胞质出现棕黄色点状或线状染色为阳性，采用IC计数法评估免疫细胞(包括淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞)染色结果，即任何强度的PD-L1阳性免疫细胞所占肿瘤面积的比例≥1%为阳性。

1.5 统计学分析采用GraphPad(Prism 5.0)和SPSS 23.0软件进行统计学处理。连续变量的差异分析采用Mann-WhitneyU检验，样本率之间的比较采用卡方检验或费舍尔精确检验，应用Spearman等级相关检验进行相关性分析。用Kaplan-Meier曲线和对数秩检验进行生存分析。使用SPSS 23.0软件进行多因素Cox回归分析。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MBC中TANs浸润及PD-L1的表达在MBC化生成分癌实质及癌间质均观察到TANs浸润。癌实质TANs浸润密度为0～283.0，浸润密度中位数为4.0。其中低密度TANs组中位数为1.0，平均数为1.4±1.0；高密度组中位数为36.0，平均数为68.2±76.7(图1～3)。癌间质TANs浸润密度中位数为1.0，化生成分癌实质TANs浸润密度高于癌间质，差异具有统计学意义(P<0.05，图4)。PD-L1在单一化生成分型MBC中的阳性率32.4%(12/37)，在混合化生成分型中的阳性率90.0%(9/10)，差异具有统计学意义(P<0.05，表1)。本实验对TANs浸润密度和PD-L1表达情况进行了自身对照，41例同时具有化生成分和NST成分病例中，化生成分中的TANs浸润密度高于NST成分(P<0.05，图5)，化生成分中的PD-L1阳性率高于NST成分(P<0.05，表2)。

图1 CD66b和PD-L1在鳞状细胞癌中的表达：A. HE染色；B. 浸润的TANs，EnVision两步法；C. PD-L1表达，Roche BenchMark XT全自动免疫组化 图2 CD66b和PD-L1在梭形细胞癌中的表达：A. HE染色；B. 浸润的TANs，EnVision两步法；C. PD-L1表达，Roche BenchMark XT全自动免疫组化 图3 CD66b和PD-L1在伴软骨样成分分化型MBC中的表达：A. HE染色；B. 浸润的TANs，EnVision两步法；C. PD-L1表达，Roche BenchMark XT全自动免疫组化

表1 MBC中TANs密度和PD-L1表达与临床病理特征的关系[n(%)]

图4 MBC癌实质和癌间质的TANs浸润密度差异

图5 TANs在MBC化生成分癌实质与NST成分癌实质中的浸润情况

表2 MBC化生成分和NST成分的PD-L1表达情况

2.2 TANs浸润密度、PD-L1表达与MBC临床病理特征的关系在MBC癌组织中，TANs高密度浸润与患者年龄>50岁、TNM高分期、远处转移、ER阴性、高Ki-67增殖指数呈正相关(P<0.05，表1)；PD-L1阳性与HER-2过表达呈正相关(P<0.05，表1)。生存分析显示，TANs浸润密度与患者3年无进展生存期(progression-free survival, PFS)呈负相关(P<0.01，图6A)，PD-L1表达与患者3年PFS无相关性(P>0.05，图6B)。MBC患者3年PFS的Cox多因素分析显示，MBC中TANs浸润密度与3年PFS密切相关(P<0.05，表3)，是较差的PFS独立危险因素。TANs浸润密度与PD-L1表达呈正相关(rs=0.309，P<0.05，图7)。

图6 A. TANs浸润密度与患者PFS的关系；B. PD-L1表达与患者PFS的关系

图7 MBC癌组织中TANs浸润密度与PD-L1表达的相关性

表3 MBC患者3年PFS的Cox多因素分析

3 讨论

肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是决定肿瘤生物学行为的关键因素之一[6]。TME包括多种免疫细胞、非免疫细胞和肿瘤细胞[7]。MBC虽然被视为一种具有相对免疫原性的乳腺癌，但研究表明，MBC的TME存在丰富的免疫细胞如肿瘤浸润淋巴细胞、中性粒细胞等浸润，并影响其肿瘤进展与预后[8]。

中性粒细胞是抵抗感染和损伤的第一道防线。过去认为，TME中中性粒细胞可能是防御性免疫反应的指标，然而最新研究显示TANs可以增强局部肿瘤的生长、促进肿瘤进展和转移[9]。TANs分泌的弹性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)在TME中可以降解胰岛素受体底物1，进而加强磷脂酰肌醇激酶(PI3K)和血小板源性生长因子受体之间的相互作用，促进癌细胞的增殖[10]。中性粒细胞释放的细胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, NETs)也能促进肿瘤细胞的增殖。NETs是由具有金属蛋白酶的DNA支架和活化的中性粒细胞释放的蛋白质组成的网状结构，NETs可直接影响肿瘤细胞，通过激活NF-κB等信号传导途径或通过NETs中的NE等蛋白酶促进其增殖[11]。NETs还能促进肿瘤转移、扩散。在小鼠结肠癌实验中发现，NETs在体外通过激活小鼠结肠癌细胞中TLR9生长信号通路释放高迁移率族蛋白B1，从而促进了癌细胞的迁移和侵袭[12]。Park等[13]的研究亦印证了这点，在小鼠三阴型乳腺癌肺转移病灶中NETs的阳性率高于原发病灶，并且使用脱氧核糖核酸酶Ⅰ抑制NETs的形成可以显著减少小鼠三阴型乳腺癌的肺转移。本组中，TANs高密度浸润MBC组相对于TANs低密度浸润MBC组具有更高的Ki-67增殖指数。这表明，MBC中TANs浸润密度和癌细胞增殖密切相关，进一步证实了TANs可能会促进癌细胞增殖。此外，本组病例中出现远处转移的6例患者均伴随TANs高密度浸润(6/6)，明显高于未转移患者。这表明TANs高密度浸润与肿瘤转移呈正相关，TANs在MBC远处转移过程可能发挥重要作用。

TANs除了促进MBC癌细胞增殖与转移，还与MBC的PFS密切相关。在本组中，TANs高密度浸润与ER阴性、高TNM分期呈正相关，与PFS呈负相关，这一结果与既往研究一致[14]。多因素分析显示，TANs浸润密度与3年PFS密切相关，浸润密度越高，患者出现肿瘤进展的风险越大。这表明，TANs高密度浸润与MBC进展密切相关，有望成为一个潜在的MBC生物学标志物。这也为MBC中针对中性粒细胞的靶向治疗提供新思路。

TANs还可以通过上调PD-L1表达，抑制T细胞增殖从而抑制肿瘤免疫反应。Shang等[15]研究证实卵巢癌中HOXA转录本可以促进中性粒细胞分泌白介素-6，上调PD-L1表达，从而抑制T细胞免疫反应，最终加速卵巢癌细胞的免疫逃逸。

乳腺癌中PD-L1表达通常与预后不良的临床病理特征呈正相关。如在一项关于PD-L1与乳腺癌临床病理特征的Meta分析中发现，PD-L1阳性与HER-2过表达密切相关[16]。本组中PD-L1阳性与HER-2过表达亦呈正相关。有研究表明HER-2过表达与MBC的恶性特征直接相关[17]。此外，PD-L1在存在一种以上化生成分MBC中的阳性率高于单一化生成分型MBC，而存在一种以上化生成分是MBC中无复发和特异性生存率的不良因素之一[18]。尽管本组中PD-L1表达与患者预后无明显相关性(或与样本量过少有关)，但PD-L1表达与MBC的恶性特征呈正相关，这提示PD-L1可能影响MBC的进展，也为开展免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors, ICIs)如PD-1/PD-L1抑制剂的免疫治疗提供证据。Al Sayed等[19]在1例转移性MBC中联合使用抗PD-L1抗体(durvalumab)与化疗药物紫杉醇，治疗效果良好且副作用小。此外ICIs在MBC中的治疗效果已进入临床研究(NCT02834013)。本组中PD-L1的阳性率为44.7%(21/47)，与既往MBC研究中PD-L1的阳性率47.6%大致相符[8]。这提示接近一半对放化疗反应不佳的MBC患者可能从ICIs治疗中获益。

研究证实肿瘤组织中中性粒细胞的浸润密度与PD-L1表达呈正相关，如胆管细胞癌中TANs密度与PD-L1表达呈正相关[20]。本实验发现，MBC中TANs浸润密度与PD-L1表达呈正相关，与上述研究结果一致。这提示TANs与PD-L1可能共同参与MBC的进展，影响MBC患者的预后。此外，针对中性粒细胞的靶向治疗还可以协助PD-1/PD-L1抑制剂发挥治疗作用。Kargl等[21]研究小鼠肺非小细胞肺癌时发现，中性粒细胞抑制剂可协助PD-1抑制剂攻击肺癌细胞，使癌灶体积缩小，延缓肿瘤产生耐药性的时间，这提示中性粒细胞抑制剂也许是ICIs有效的辅助治疗手段。

综上所述，化生成分癌实质中浸润的TANs与MBC进展及PD-L1表达呈正相关，有望成为MBC无进展生存率的潜在生物学标志物。