乳腺癌中环状RNA circ_0030777的表达及其临床意义

汪园园，柯 璟，刘 希，李晓锋，常红云，杨 喆，张冠军

乳腺癌是影响女性身心健康的常见恶性肿瘤之一。我国女性乳腺癌的发病率居于女性恶性肿瘤的首位，2015年我国乳腺癌新发病例约30.4万例，占女性恶性肿瘤发病的17.10%[1]。环状RNA是一种新型非编码RNA，近期研究表明，环状RNA在多种肿瘤中异常表达，如肝癌、胃癌、结直肠癌，且与肿瘤的发生、发展及患者的预后有关[2-3]。在乳腺癌中，环状RNA也具有重要作用[4]。本实验主要通过qRT-PCR法检测环状RNA circ_0030777在乳腺癌中的表达，探讨其临床意义及其作为肿瘤分子标志物的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1组织标本 收集2014年6月～2015年12月西安交通大学第一附属医院存档的手术标本，包含124例乳腺癌、4例癌旁正常乳腺组织及38例良性病变乳腺组织。纳入标准：所有患者均为女性，年龄18～80岁，术前均未行放、化疗及新辅助治疗。124例乳腺癌患者年龄35～80岁，平均52岁。其中非特殊型浸润性癌Ⅱ级19例，非特殊型浸润性癌Ⅲ级88例，浸润性小叶癌3例，筛状癌1例，黏液癌3例，浸润性微小乳头状癌4例，伴髓样特征的癌6例。38例乳腺良性病变患者年龄16～60岁，平均34.58岁，均为乳腺纤维腺瘤。所有患者均签署知情同意书，手术后标本立即放入液氮中保存，标本经过两位病理医师进行诊断。

1.1.2 主要试剂鼠抗人ER单克隆抗体、鼠抗人PR单克隆抗体和鼠抗人Ki-67单克隆抗体均购自福州迈新公司，鼠抗人HER-2单克隆抗体购自罗氏公司，GLP HER2/CSP17探针试剂盒购自广州安必平医药公司，RNA提取试剂TRIzol和qRT-PCR试剂盒SYBR均购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，PCR试剂盒购自康为世纪公司。

1.2 方法

1.2.1HE和免疫组化染色 所有标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色。切取典型病变组织(3 μm厚)，根据说明书进行采用Ventana(Roche公司)全自动免疫组化染色仪进行EnVision两步法染色。ER和PR结果判读标准：计数100个以上的肿瘤细胞，≥1%的肿瘤细胞核阳性判读为阳性，﹤1%则判读为阴性[5]。HER-2结果判读依据乳腺癌HER2检测指南(2019版)[6]。Ki-67增殖指数为肿瘤细胞中阳性细胞所占百分比。

1.2.2FISH 使用HER-2双色探针对免疫组化HER-2 2+的乳腺癌组织进行FISH检测，操作步骤根据试剂盒说明书进行：石蜡切片3 μm厚，60 ℃烤片2 h，二甲苯脱蜡，乙醇去二甲苯，95 ℃蒸馏水煮片20 min，室温晾干，37 ℃蛋白酶消化10 min，SSC缓冲液洗涤10 min，梯度乙醇脱水，室温晾干，后续实验步骤均避光操作，滴加HER-2探针，橡胶水泥封固，杂交仪过夜(85 ℃ 5 min；37 ℃过夜)。次日，洗涤切片，滴加DAPI复染液至组织上，分析荧光信号。HER-2 FISH判读依据乳腺癌HER2检测指南(2019版)[6]。

1.2.3qRT-PCR 采用TRIzol提取组织中的RNA，逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，进行PCR。环状RNA circ_0030777上游引物：5′-TGACAGACAATAAGGGCGAAG-3′，下游引物：5′-TCGAGAAGCAGGTGGAAACAT-3′；内参GAPDH上游引物：5′-GTCAGCCGCATCTTCTTTTG-3′，下游引物：5′-GCGCCCAATACGA CCAAATC-3′。使用普通PCR试剂盒进行PCR，反应条件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,41个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃下保存。产物跑胶后，送华大基因公司测序；使用SYBR进行qRT-PCR检测，反应条件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，41个循环。使用2-ΔΔCt法计算mRNA表达水平。

1.3 统计学方法实验数据采用两独立样本的秩和检验(Wilcoxon rank test)与χ2检验，相关性分析采用Spearman相关性分析，应用GraphPad Prism 5.0软件绘图。双侧P<0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织中环状RNA circ_0030777的表达根据HE染色，确定标本组织病变类型，分别为乳腺癌、癌旁正常乳腺组织及良性病变乳腺组织(图1)。采用环状RNA芯片筛选技术抽取4例乳腺癌及对应癌旁乳腺组织，筛选出在乳腺癌中特异性低表达的环状RNA circ_0030777，作为后续实验靶标。环状RNA circ_0030777在乳腺癌与癌旁组织中表达量相差56倍(P=0.001)。

本组采用PCR对芯片结果进行进一步验证，测序结果显示扩增的序列跨越目标基因反向剪接序列(图2)，与目标基因的序列相符。qRT-PCR结果显示，环状RNA circ_0030777在124例乳腺癌组织中的表达低于38例乳腺良性病变组织(P<0.001，图3)，符合芯片表达结果。

图2 环状RNA circ_0030777及GAPDH基因qRT-PCR的扩增曲线、熔解曲线图及测序后的环状RNA拼接位点示意图：A.扩增曲线；B.熔解曲线，红色线条为目标基因，绿色线条为内参基因；C.拼接位点示意图

图3 乳腺癌组织及良性病变组织中环状RNA circ_0030777的表达差异

2.2 乳腺癌中环状RNA circ_0030777表达与临床病理特征的相关性以组织病理诊断为金标准，区分乳腺癌组织和乳腺良性病变组织，用qPCR检测环状RNA circ_0030777表达水平所得数据制作ROC，得到ROC曲线下面积(area under curve,AUC)为0.866 7(95%CI：0.803 7～0.929 7)，根据约登指数，得到截点cut-off为9.598E-4，灵敏度Sen为0.580 6(95%CI：0.488 7～0.668 6)，特异度Spe为0.973 7(95%CI：0.861 9～0.999 3)，具有统计学意义(P<0.000 1，图4)。

图4 环状RNA circ_0030777诊断乳腺癌的ROC曲线

根据ROC将环状RNA circ_0030777表达水平分成高表达组和低表达组，分析环状RNA circ_0030777表达水平与乳腺癌临床病理特征的关系。经统计学分析发现，环状RNA circ_0030777表达与ER、PR和Ki-67表达水平(图5)有关(P<0.05)，而与患者年龄、肿瘤部位、组织学分型、HER-2状态(图5、6)、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移、分子分型及组织学分型等均无相关性(P>0.05)。进一步Spearman相关性分析结果显示，hsa_circ_0030777低表达率与ER表达状态相关(r=0.243，P=0.046)，ER阳性组hsa_circ_0030777低表达率低；PR阳性组hsa_circ_0030777低表达率低(r=0.187，P=0.007)；Ki-67阳性组hsa_circ_0030777低表达率低(r=0.179，P=0.047,表1)。

图5 乳腺癌中ER、PR、HER-2、Ki-67的表达，EnVision两步法：A.ER阴性；B.ER阳性；C.PR阴性；D.PR阳性；E.HER-2 0；F.HER-2 3+；G.Ki-67阴性；H.Ki-67阳性 图6 乳腺癌免疫组化HER-2 2+行FISH法检测：A. HER-2阴性；B. HER-2阳性

表1 环状RNA circ_0030777表达与乳腺癌临床病理特征的关系

3 讨论

乳腺癌是我国女性发病率最高的恶性肿瘤，尽管在诊断和治疗方面取得了一定进展，相对于其他肿瘤的5年生存率(82.0%)较高，但我国与发达国家比较还存在较大差距(90.9%)[1,7]，其主要原因是临床早期就诊率低，以及晚期病例临床诊治不规范。因此，早期诊断和及时治疗是提高乳腺癌患者生存率与生存质量的关键[8]。

近年来，研究发现环状RNA在乳腺癌中稳定表达，且越来越多的报道显示环状RNA在乳腺癌中异常表达，并且发挥重要作用[4]。Lu等[9]对4例乳腺癌肿瘤组织和癌旁正常组织进行环状RNA微阵列检测发现，715个在乳腺癌中上调，440个下调的环状RNA。Wang等[10]通过RNA测序和芯片技术发现了480个在转移性乳腺癌中较原位癌中有差异的环状RNA，5 842个在MDA-MB-231和MCF-7乳腺细胞中表达差异的环状RNA。CircSKA3高表达通过侵袭伪足的形成，促使体内和体外肿瘤侵袭性增加，促进乳腺癌的进展[11]。环状RNA circANKS1B和circAGFG1在三阴型乳腺癌组织及细胞中高表达，circANKS1B表达与淋巴结转移，进展期乳腺癌有关，通过与miR-148a-3p和miR-152-3p的海绵作用，促进上皮-间质转化[12]。

本实验通过环状RNA芯片筛选出特异性低表达的环状RNA circ_0030777，通过qRT-PCR和Sanger测序进一步验证发现，与良性病变组织比较，乳腺癌中环状RNA circ_0030777表达明显下调，通过ROC曲线发现，circ_0030777是乳腺癌中的一种较好的分子标志物。以ROC曲线截点为分界点，将环状RNA circ_0030777表达分为高表达组和低表达组，进一步发现，环状RNA circ_0030777表达与ER、PR和Ki-67有关。Ki-67是与细胞增殖密切相关的细胞核蛋白，在有丝分裂时逐渐增加到最大值[13]。肿瘤细胞中Ki-67表达水平变化与肿瘤细胞的增殖活性有关，部分反映了肿瘤的侵袭性，而肿瘤细胞的侵袭性与疾病预后密切相关。欧洲肿瘤标志物小组指南中提出，Ki-67表达升高与乳腺癌患者的不良预后独立相关[14]。ER和PR作为乳腺癌内分泌治疗的重要指标，表明了其在乳腺癌发生、发展过程中的重要地位。研究显示，ER在乳腺癌组织中的表达高于非乳腺癌组织；而乳腺癌高发人群较低发人群的乳腺上皮中有更多ER表达，ER可以促进乳腺正常和新生上皮细胞的增殖，从而增加乳腺癌的发病率及复发率[15]。这些证据均表明circ_0030777在乳腺癌中的重要作用。

综上所述，环状RNA是乳腺癌诊断和预后的重要生物学标志物。本实验结果显示，环状RNA circ_0030777在乳腺癌中低表达，提示其在乳腺癌的发生、发展中具有重要作用。Circ_0030777低表达与ER、PR和Ki-67表达相关，为其成为高特异性和敏感性的乳腺癌分子标志物提供实验依据。