人脑胶质瘤组织中Spinophilin的表达及临床意义

邢靖松，梁 东，克甜甜，张 琳，于如同，高尚锋

胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤，呈浸润性生长，易复发，5年生存率不足5%[1]。随着分子病理学的发展，寻找与胶质瘤恶性进展相关的关键分子，评估其与胶质瘤患者预后的关系具有重要意义。Spinophilin又名PPP1R9B，最早在神经元树突棘中被发现[2]，可以与多种跨膜蛋白结合，调控细胞胞外信号向胞内传导的生物学过程[3]。现有研究表明，Spinophilin在肝癌[4]和乳腺癌[5]中发挥抑癌作用，然而其在人脑胶质瘤组织中的表达及临床意义尚未见报道。本文旨在探讨Spinophilin在脑胶质瘤组织中的表达及临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料收集2016年2月～2018年2月徐州医科大学附属医院神经外科行手术治疗的胶质瘤标本，标本均取自瘤中央，无出血、坏死、囊变，且未予电凝。所有胶质瘤患者均为原发，术前均未行任何抗肿瘤治疗。非瘤脑组织标本取自同一时期颅脑外伤患者通过内减压术切除的新鲜脑组织。共收集冷冻标本42例(非瘤脑组织9例，胶质瘤组织33例)，所有标本提取了总蛋白用于Western blot检测，6例非瘤脑组织和26例胶质瘤组织提取了总RNA用于qRT-PCR检测；石蜡标本29例，其中非瘤脑组织7例，胶质瘤组织22例。患者性别、年龄、WHO级别、IDH分型等均从临床病历记录中获得。本实验获患者及家属知情同意，徐州医科大学医学伦理委员会批准。

1.2 qRT-PCR检测TRNzol试剂提取组织总RNA，Nano Drop分光光度计和琼脂糖电泳测定RNA浓度及纯度。Takara公司反转录试剂盒生成cDNA，反应条件：55 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min后置于4 ℃。以cDNA为模板，加入SYBR-Green染料复合物、Spinophilin上游引物5′-GCCCAGCTAATTCAG CAGAC-3′和下游引物5′-GGAGCTCCTTGAACTTGT GC-3′，在ABI 7500 PCR反应仪上进行PCR扩增，反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，45个循环。以β-actin作为内参，对Spinophilin核酸表达量进行定量分析。

1.3 免疫组化石蜡切片脱蜡、水化，在柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中进行抗原修复，滴加Spinophilin一抗(1 ∶200稀释，AB5669，Millipore公司)，室温孵育1 h后4 ℃过夜，次日按Vector公司ABC试剂盒说明书操作，DAB显色，苏木精复染，切片脱水、透明、封片，显微镜下拍照，Image J软件分析细胞核总数和Spinophilin阳染细胞数，计算Spinophilin阳性细胞百分比。

1.4 Western blot检测组织标本匀浆后提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取等量组织样品总蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳、转膜、封闭后，按1 ∶10 000加入Spinophilin多克隆抗体(Millipore公司)和β-actin单克隆抗体(sc-47778，1 ∶1 500稀释，Santa cruz公司)，4 ℃孵育过夜，次日加入二抗(1 ∶4 000稀释)，室温孵育2 h，滴加ECL化学发光液，在Bio-Rad化学发光成像系统拍照，使用Image J软件进行灰度扫描，以β-actin作为内参计算Spinophilin的相对蛋白表达量。

1.5 生物信息学分析本组涉及的公共胶质瘤数据集来自于以下网站：CGGA中国脑胶质瘤基因组图谱计划(http://www.cgga.org.cn/index.jsp)、TCGA美国肿瘤基因组图谱数据(https:// cancergenome.nih.gov)、GSEl6011和GSE4290 mRNA芯片数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc)，利用R2(https://hgserver1.amc.nl)和GEPIA两个在线工具分析上述数据集，获得Spinophilin基因表达差异和Kaplan-Meier生存曲线图。

1.6 统计学方法采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，采用Kruskal-Wallis检验和Mann-WhitneyU检验。以P<0.05表述差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Spinophilin基因在不同级别胶质瘤组织中的表达变化在TCGA胶质瘤数据集中，与非瘤脑组织相比，Spinophilin在低级别胶质瘤及胶质母细胞瘤中的表达量均降低，在胶质母细胞瘤中的表达差异有统计学意义(P<0.05，图1A、B)。在GSE16011和GSE4290胶质瘤数据集中，与非瘤脑组织相比，Spinophilin在WHO Ⅲ级(P<0.01)和Ⅳ级(P<0.001)胶质瘤中低表达(图1C、D)。应用qRT-PCR检测本组26例胶质瘤样本也发现，Spinophilin mRNA在WHO Ⅱ～Ⅳ级胶质瘤中表达量均有所下降，在WHO Ⅳ级中的表达差异有统计学意义(P<0.05，图1E)。

图1 A.TCGA低级别脑胶质瘤数据集中Spinophilin表达：非瘤脑组织207例，肿瘤组织518例；B.TCGA胶质母细胞瘤数据集中Spinophilin表达：非瘤脑组织207例，肿瘤组织163例；C.GSE16011胶质瘤数据集中Spinophilin表达：非瘤脑组织8例，胶质瘤WHO Ⅱ级24例，Ⅲ级85例，Ⅳ级159例；D.GSE4290胶质瘤中Spinophilin表达：非瘤脑组织27例；胶质瘤WHO Ⅱ级45例，Ⅲ级31例，Ⅳ级77例；E.本组胶质瘤中Spinophilin表达：非瘤脑组织6例，胶质瘤WHO Ⅱ级10例，Ⅲ级8例，Ⅳ级8例；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

2.2 不同IDH分型胶质瘤中Spinophilin基因的表达在GSE16011胶质瘤数据集中，Spinophilin在IDH1野生型胶质瘤组织中表达低于IDH1突变型，差异有统计学意义(P<0.05，图2A)；CGGA数据集中与该结果类似(P<0.001，图2B)。本组33例胶质瘤冷冻样本中具有明确IDH1状态的病例17例，qRT-PCR检测亦证实，Spinophilin mRNA在IDH1野生型胶质瘤中的表达低于IDH1突变型(P=0.10，图2C)。

图2 不同IDH分型胶质瘤中Spinophilin的表达：A.GSE16011胶质瘤数据集中Spinophilin表达，IDH突变型83例，IDH野生型143例；B.CGGA胶质瘤数据集中Spinophilin表达，IDH突变型356例；IDH野生型286例；C.本组胶质瘤中Spinophilin的表达，IDH1突变型10例，IDH1野生型7例；*P<0.05，***P<0.001

2.3 不同级别胶质瘤中Spinophilin蛋白的表达免疫组化检测Spinophilin蛋白阳性主要定位于细胞质(图3A)，与非肿瘤脑组织相比，Spinophilin阳性细胞百分比在不同级别胶质瘤组织中均有所下调，在WHO Ⅱ级(P<0.01)、Ⅲ级(P<0.01)中差异均具有统计学意义(图3B)。Western blot检测结果显示，与非瘤脑组织相比，Spinophilin蛋白在胶质瘤组织中的表达下降，在WHO Ⅳ级胶质瘤组织中的表达差异有统计学意义(P<0.01，图4)。

2.4 Spinophilin表达与胶质瘤患者预后的关系在CGGA胶质瘤数据集分析发现(图5)，Spinophilin高表达预示着胶质瘤患者预后较好，其高表达与较好的预后主要存在于WHO Ⅱ级(P=0.041)和Ⅲ级(P=0.033)胶质瘤，而不是WHO Ⅳ级胶质瘤(P=0.39)。

图5 CGGA数据集分析Spinophilin与胶质瘤患者预后的关系：A.WHO Ⅱ～Ⅳ级胶质瘤中Spinophilin高表达组的总生存时间显著长于低表达组，n=409；B.WHO Ⅱ级胶质瘤中Spinophilin高表达与较长的总生存时间显著相关，n=133；C.WHO Ⅲ级胶质瘤中Spinophilin高表达与较长的总生存时间显著相关，n=141；D.在WHO Ⅳ级胶质瘤中Spinophilin表达与生存期无关，n=135

3 讨论

蛋白磷酸酶与蛋白激酶共同调节底物的磷酸化，在肿瘤细胞增殖和浸润中发挥重要作用[6]。Spinophilin最早被视作一种与磷酸酶PP1结合的蛋白质[7]，近年研究发现，其在肝癌、乳腺癌等肿瘤组织中低表达[4,8]。本组亦发现，胶质瘤中Spinophilin mRNA和蛋白均低表达，并与患者较短的生存期相关。此外，在肺癌特别是鳞状细胞癌中，Spinophilin下调与患者不良预后密切相关[9]。因此，Spinophilin可能是一个重要的肿瘤抑制蛋白。

文献报道在肝癌细胞中下调Spinophilin，可增加Cyclin D2的表达，促进细胞增殖[4]。在乳腺癌细胞中，下调Spinophilin可增加肿瘤细胞干细胞特性，提高乳腺癌细胞侵袭能力[10]。低表达Spinophilin的胶质母细胞瘤细胞显示出，Rac1活性降低、侵袭伪足数量增加和细胞外基质降解增强；实验还证实，过表达Spinophilin可抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭[11]。Spinophilin作为肌动蛋白的结合蛋白，与细胞运动密切相关[12]，其在调控肿瘤细胞侵袭中的作用及机制有待进一步研究。此外，Spinophilin低表达或缺失在肺癌和结直肠癌中常伴随TP53基因突变，两者可能在肿瘤发生上存在一定的协同作用[13]，具体机制有待进一步分析。

综上所述，本组通过大样本数据分析和小样本实验验证发现，Spinophilin在脑胶质瘤中低表达，与患者较差的预后相关。Spinophilin有望成为胶质瘤分子病理诊断的生物标志物和抗胶质瘤药物研发的新靶点。但本课题中纳入临床样本量有限，导致本组部分实验结果与公共数据库数据存在一定偏倚。